Содержимое (Table of Contents)
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Вакцина антирабическая ФС.3.3.1.0025.15
культуральная концентрированная Взамен ГФ Х, ст.715,
очищенная инактивированная ФС 42-3447-97
Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину антирабическую культуральную концентрированную очищенную инактивированную, которая представляет собой лиофилизированный препарат, содержащий производственный штамм «Внуково-32» фиксированного вируса бешенства, выращенный в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, концентрированный, очищенный и инактивированный УФ-излучением или УФ-излучением в сочетании с обработкой формальдегидом.
Одна прививочная доза вакцины должна содержать вируса бешенства антиген специфический инактивированный, имеющий специфическую активность не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ).
Вакцина не содержит консервантов и антибиотиков.
Вакцину выпускают в комплекте с растворителем – водой для инъекций.
Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная предназначена для профилактики бешенства.
Производство вакцины для профилактики бешенства должно быть основано на системе посевных материалов (seed lot system), включающей главный посевной материал и рабочий посевной материал производственного штамма «Внуково-32» фиксированного вируса бешенства.
Количество пассажей полностью охарактеризованного главного посевного вирусного материала для получения рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства вакцины, не должно превышать 5.
Рабочий посевной вирусный материал должен отвечать следующим требованиям.
Производственный штамм вируса бешенства должен нейтрализоваться иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не должен нейтрализоваться сывороткой крови крупного рогатого скота нормальной. Индекс нейтрализации – не менее 100.
Для испытания параллельно готовят 2 ряда разведений вируса в диапазоне (1:5) — (1:50000) с кратностью разведения 10. В качестве среды разведения используют 2 % раствор сыворотки крови лошади нормальной, приготовленный с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56 о С в течение 30 мин. Для получения разведений вируса в первую пробирку каждого ряда, соответствующую разведению 1:5, вносят 0,4 мл среды разведения, в остальные пробирки ряда– по 0,45 мл среды разведения. В первую пробирку каждого ряда добавляют по 0,1 мл восстановленной суспензии вируса бешенства штамм «Внуково-32» и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее готовят ряд последовательных разведений путем переноса 0,05 мл смеси из предыдущей пробирки в следующую пробирку, каждый раз используя новую пипетку. Из последней пробирки, соответствующей разведению 1:50000, удаляют 0,05 мл смеси. В результате конечный объем содержимого каждой пробирки составит 0,45 мл смеси.
В каждую пробирку первого ряда вносят по 0,45 мл иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади, в каждую пробирку второго ряда –по 0,45 мл сыворотки крови крупного рогатого скота нормальной, инактивированной при температуре 56 °С в течение 30 мин. В результате получают 2 ряда разведений вируса бешенства штамм «Внуково-32» в диапазоне от 10 -1 до 10 -5 . Содержимое пробирок осторожно перемешивают путем встряхивания и инкубируют при температуре (37 ± 1) о С в течение (75 ± 15) мин. Затем пробирки быстро охлаждают на льду до комнатной температуры и каждым разведением вируса бешенства в объеме 0,03 мл интрацеребрально заражают по 6 беспородных мышей массой 9-10 г. За животными наблюдают 14 дней. Мышей, павших в течение первых 4 дней, при расчетах не учитывают. Титр вируса, использованного для заражения каждой из 2 групп мышей, вычисляют по методу Рида и Менча. Индекс нейтрализации рассчитывают путем вычитания логарифма обратного разведения, соответствующего LD50 вируса в смеси с иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади, из логарифма обратного разведения, соответствующего LD50 вируса в смеси с сывороткой крупного рогатого скота нормальной. Если полученная разница превышает 2, то индекс нейтрализации больше 100.
Не должен содержать бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, и грибов. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».
Испытание на отсутствие микобактерий туберкулеза проводят путем посева на среду Левенштейна-Йенсена.
Не должен содержать микоплазм. Испытание проводят микробиологическим методом в соответствии с ОФС «Испытание на присутствие микоплазм».
Не должен содержать посторонних вирусных агентов по результатам испытания на 20 мышах-сосунках, испытания на 20 беспородных белых мышах массой 15-20 г, испытания на 5 морских свинках массой 350 — 500 г, испытания на культурах клеток.
Используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Мышам-сосункам вводят по 0,01 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 0,1 мл интраперитонеально, период наблюдения – 14 сут. Беспородным белым мышам вводят по 0,03 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 0,5 мл интраперитонеально, период наблюдения – 28 сут. Морским свинкам вводят по 0,1 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 5 мл интраперитонеально, период наблюдения – 42 сут.
Не менее 10 -6 LD50/мл при интрацеребральном заражении новорожденных беспородных белых мышей массой 6–8 г.
Не менее 1,0 МЕ. Определение проводят методом NIH (раздел «Испытания готового продукта»).
Для производства вакцины используют первичную культуру клеток почек сирийских хомячков. Почки для получения культуры клеток забирают у клинически здоровых хомячков.
При работе с культурами клеток запрещается использовать антибиотики группы пенициллинов.
Необходимо проводить испытания производственной культуры клеток на стерильность и на отсутствие посторонних вирусных агентов путем изучения феномена гемадсорбции и цитопатических изменений на чувствительных тест-системах: культуре клеток, используемой для производства вакцины, культуре клеточной линии из другого источника, культуре диплоидных клеток человека.
При наличии гемадсорбции и (или) цитопатических изменений в контрольных культурах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии.
Если при повторном исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирус, полученный в соответствующих зараженных культурах, не должен быть использован для производства вакцины.
Все вещества животного происхождения, используемые для получения производственной культуры клеток и культивирования вируса бешенства, проверяют на отсутствие бактерий, грибов, микоплазм и посторонних вирусных агентов. Для размножений клеток не следует применять сыворотки человеческого происхождения.
Все этапы производства должны быть валидированы.
Методы концентрации и очистки вируссодержащей жидкости указывают в нормативной документации. Допускается концентрация и очистка методом ультрафильтрации или концентрация методом ультрафильтрации с последующей очисткой методом гель-хроматографии.
Инактивацию проводят сразу после этапа очистки. При использовании физического метода инактивации отрабатывают режим инактивации: скорость подачи вируссодержащей жидкости, частоту вращения диска инактиватора, интенсивность излучения.
Запрещается использовать в производстве антибиотики после технологического этапа сбора вируссодержащей культуральной жидкости.
В качестве стабилизаторов используют разрешенные вещества, указанные в нормативной документации.
Испытание полуфабриката на стерильность проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации, после добавления в вакцину стабилизаторов (испытывают смесь для лиофилизации), в процессе розлива.
Испытание полуфабриката на отсутствие микоплазм проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации.
При использовании дополнительного метода инактивации формальдегидом в полуфабрикате определяют остаточное количество формальдегида. Содержание формальдегида в полуфабрикате – не более 60 мкг/мл.
Испытание полуфабриката на содержание общего белка проводят до добавления стабилизаторов – сахарозы и желатина. Содержание общего белка в полуфабрикате должно быть от 4,7 до 5,0 мг/мл. Определение проводят методом Лоури в соответствии с ОФС «Определение белка».
По показателю «Герметичность» испытывают все ампулы серии. Для проведения испытания ампулы помещают в кассеты, заполненные водой, подкрашенной любым водно-растворимым красителем. Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы полностью находились в воде. Емкость герметично закрывают и создают в ней избыточное давление, по сравнению с атмосферным, – (100 ± 20) кПа. Давление выдерживают не менее 15 мин, после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. Емкость открывают, кассеты с ампулами вынимают и просматривают на наличие в них подкрашенной воды. Ампулы, содержащие подкрашенную воду, считают не выдержавшими испытание.
Пористая масса белого цвета, гигроскопична. Определяют визуально.
Вакцина должна вызывать специфический иммунитет к вирусу бешенства при иммунизации мышей. Испытание проводят одновременно с испытанием специфической активности. Определение проводят по разделу «Специфическая активность».
Должна полностью растворяться в течение 5 мин при внесении 1 мл растворителя (вода для инъекций) на 1 дозу вакцины. Определение проводят визуально.
Прозрачная или слабо-опалесцирующая жидкость, не более эталона I. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».
Не более эталона Y4. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».
От 7,2 до 7,8. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Не более 2,0 %. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».
Не более 0,5 мкг в 1 дозе. Определяют методом ракетного иммуноэлектрофореза в соответствии с ОФС «Определение бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза в иммунобиологических лекарственных препаратах». В качестве антисыворотки допускается использовать сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови рогатого скота адсорбированную кроличью диагностическую для судебно-медицинских целей жидкую. Чувствительность сыворотки определяют предварительно и используют в концентрации, при которой с 0,5 мкг/мл БСА образуется четкая ракета с высотой пика не менее 1 мм.
Должна быть стерильной. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации на тиогликолевой среде в соответствии с ОФС «Стерильность».
Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Доза препарата для введения составляет 1 прививочную дозу, вводимую внутривенно в объеме 1 мл.
Должна быть нетоксичной. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Морским свинкам вводят по 2 мл восстановленной растворителем вакцины подкожно, мышам – по 1 мл восстановленной растворителем вакцины внутрибрюшинно.
Вакцина не должна содержать живой вирус бешенства.
Для определения специфической безопасности проводят пассаж вакцины в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. В 2 флакона, содержащие питательную среду с гидролизатом лактальбумина (0,5 %) в растворе Хенкса для культур клеток, вносят по 200 мл клеточной взвеси, содержащей 300-600 тыс клеток/мл. В среду добавляют 10 % раствор сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой.
В качестве контроля используют 2 флакона с незараженной первичной культурой клеток почек сирийских хомячков.
Объем и концентрация клеток, вносимых в опытные и контрольные флаконы, должны быть одинаковыми.
Культуру инкубируют в течение 5-6 сут при температуре (36 ± 1) ºС. Затем отбирают флаконы с полностью сформировавшимся клеточным монослоем. Для испытания на специфическую безопасность от каждой серии отбирают по 25 ампул с препаратом. В каждую ампулу вносят по 1 мл растворителя. Восстановленную вакцину объединяют в одну емкость. Из отобранных флаконов с культурой клеток сливают культуральную жидкость. В каждый опытный флакон вносят по 12,5 мл растворенной вакцины, 2 незараженных флакона оставляют (контрольные). Все флаконы инкубируют при температуре (36 ± 1) о С в течение 90 мин, после чего в опытные и контрольные флаконы вносят по 200 мл питательной среды с гидролизатом лактальбумина (0,5 %) в растворе Хенкса для культур клеток. В поддерживающую среду добавляют 5 % СКРС и канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл или 4 % раствор для инъекций гентамицина сульфата до конечной концентрации 80 мкг/мл. На -8 сут инкубации при температуре (32 ± 1) о С из каждого опытного флакона отбирают по 5 мл культуральной жидкости, смешивают пробы и вводят в головной мозг по 0,03 мл смеси 10 беспородным мышам массой от 6 до 7 г.
Аналогично испытывают культуральную жидкость из контрольных флаконов.
За животными наблюдают 21 сут. За весь период наблюдения не должно регистрироваться ни одного случая смерти от бешенства животного, получившего культуральную жидкость из опытных флаконов. Диагноз устанавливают на основании результатов иммунофлуоресценции (РИФ).
В случае, если в опытной группе зарегистрирована неспецифическая гибель (в первые 4 сут наблюдения) более 2 мышей, испытание повторяют.
При появлении хотя бы у 1 мыши клинических признаков бешенства (тремор конечностей, атаксия, паралич) или при гибели более 2 мышей без клинических признаков заболевания, начиная с 5 сут наблюдения, головной мозг павших животных исследуют методом иммунофлуоресценции. При получении положительных результатов серию считают не выдержавшей испытания; при получении отрицательного результата проводят повторный контроль на удвоенном количестве образцов вакцины и удвоенном количестве мышей.
В случае отрицательного результата при повторном испытании считают, что вакцина не содержит живого вакцинного вируса бешенства. В случае регистрации при повторном контроле хотя бы у 1 мыши клинических признаков бешенства, подтвержденного иммунофлуоресценцией, испытуемую серию вакцины считают не выдержавшей испытания.
Не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ) в 1 дозе.
Определение специфической активности проводят по методике Национального института здоровья США (NIH). Специфическую активность испытуемой вакцины определяют в сравнении со стандартным образцом (СО) специфической активности вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной, калиброванным по отношению к Международному стандарту антирабической вакцины. Для определения специфической активности от серии отбирают не менее 3 ампул на каждую иммунизацию.
В каждую ампулу вносят растворитель из расчета 1 мл на 1 дозу вакцины. Полученные растворы объединяют и готовят ряд разведений с пятикратным интервалом в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625; 1:3125 на
0,9 % стерильном растворе натрия хлорида или на среде 199, содержащей
0,1 % альбумина. Разведения, используемые для иммунизации животных, указывают в нормативной документации.
Аналогичным образом готовят разведения стандартного образца, предварительно восстановленного водой для инъекций до содержания 1 МЕ
в 1 мл.
Пробирки с разведенной вакциной и стандартным образцом хранят на льду в течение времени постановки опыта, но не более 4 ч.
Для иммунизации используют мышей линии Balb/c или беспородных мышей массой (12 ± 2) г без различия пола. Каждым разведением вакцины и стандартного образца иммунизируют не менее 11 животных; 40 мышей из этой же партии (контрольная группа) содержат в отдельных клетках до проведения титрования фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» (тест-штамм). Мышей иммунизируют внутрибрюшинно по 0,5 мл 2 раза с интервалом 7 сут. На 7 сут после второй иммунизации вводят фиксированный вирус бешенства штамм CVS интрацеребрально в объеме 0,03 мл шприцем вместимостью 1 см 3 . Для заражения всех иммунизированных животных применяют разрешающее (рабочее) разведение вируса бешенства, содержащее от 20 до 100 LD50/0,03 мл вируса.
Одновременно с заражением иммунизированных мышей на неиммунизированных мышах из контрольной группы проводят титрование фиксированного вируса бешенства штамм CVS для определения точной дозы вируса, взятой в испытание. Для этого используют разрешающее (рабочее) разведение вируса (10 0 ) и его десятикратные разведения (10 -1 ; 10 -2 ; 10 -3 ) на
2 % растворе сыворотки крови лошади нормальной, приготовленном с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56 о С в течение 30 мин. Каждым разведением вируса заражают не менее чем по 10 мышей интрацеребрально в объеме 0,03 мл.
За мышами наблюдают в течение 14 сут. При оценке результатов опыта учитывают мышей, заболевших или павших с 5 по 14 сут. Учет проводят ежедневно. Клиническими симптомами на разных стадиях развития заболевания могут быть: взъерошенная шерсть, замедленные и/или круговые движения, дрожание, парез, параличи.
После окончания опыта вычисляют точное количество вируса, содержащееся в 0,03 мл разрешающего разведения, по методу Рида и Менча.
Рассчитывают конечные разведения вакцины и стандартного образца, защищающие 50 % животных (КР50), по следующей формуле:
Т – показатель степени десятичного логарифма;
А – логарифм обратной величины разведения, при котором смертность животных ниже 50 %;
В – показатель смертности животных ниже 50 %;
С – показатель смертности животных выше 50 %;
Д – логарифм кратности разведения.
Специфическую активность испытуемой вакцины (СА) определяют в МЕ относительно специфической активности стандартного образца по формуле:
К – величина, обратная КР50 испытуемой вакцины;
М – величина, обратная КР50 стандартного образца;
У – количество МЕ в 1 мл восстановленного стандартного образца (1 МЕ);
В том случае, когда при проведении испытания специфическая активность вакцины менее нормативных требований, допускается проведение повторного испытания.
Вакцина должна быть термостабильной. После инкубирования образцов при температуре 37 ºС в течение 4 недель специфическая активность вакцины должна быть не менее 2,5 МЕ в 1дозе (раздел «Специфическая активность»). Испытанию на «Термостабильность» подвергают не менее 2 серий вакцины ежегодно.
В нормативной документации указывают растворитель и методику, по которой проводят испытания растворителя.
Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С в соответствии сОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».
источник
Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин. Способ включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства «Щелково-51», инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса и последующее приготовление целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21. При этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50. Полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства «Щелково-51» проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38 o С. При более производительном и технологическом способе изготовления вакцина обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будет защищать животных от бешенства. Этот эффект объясним тем, что в результате термообработки в популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин против бешенства животных.
Известен способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию вируса бешенства штамм «Щелково-51» в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, внесение по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию стабилизатора — полиакриловую кислоту или ее соль, затем инактиватора — димер этиленимина ((ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%, инкубации смеси при 37 o С в течение 20-24 ч с последующей расфасовкой полученной вакцины для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде ((RU 2134590 С, опубл. 20.08.1999).
Однако в известном способе ДЭИ используют в высокой концентрации, что приводит к значительной потере первоначальной иммуногенной активности вируса в процессе изготовления вакцины.
Кроме того, в получаемом материале, особенно на первых этапах репродукции, содержится значительное количество неполноценных дефектных вирионов, что не в полной мере способствует проявлению иммуногенной потенции штамма «Щелково-51».
Наиболее близким аналогом является способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию штамма вируса бешенства «Щелково-51» в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию инактиватора бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при температуре 4-6 o С в течение 2-4 ч с последующим добавлением стабилизирующей среды на основе пептона, сахарозы и желатина, и адъюванта сапонина (RU 955577 А, опубл. 15.08.1994).
Недостатком ближайшего аналога является то, что по существующей технологии обязательна стадия получения посевного материала путем размножения вируса «Щелково-51» в мозге овец. Из-за значительной инфицированности овец возбудителем скрейпи существует постоянная угроза его попадания с мозговой тканью в состав изготовляемой вакцины, как следствие этого, распространение прионовой инфекции среди прививаемого поголовья сельскохозяйственных и домашних животных. Поэтому процесс получения мозгового посевного материала является очень ответственной, трудоемкой и дорогостоящей операцией, связанной с тщательным отбором животных и контролем мозговой вируссодержащей ткани и изготовленных серий вакцины на наличие посторонних агентов.
Задачей изобретения является усовершенствование промышленной технологии производства антирабической вакцины из штамма «Щелково-51».
Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении затрат, повышении иммуногенности и безопасности получаемой вакцины за счет получения полноценных вирионов с полным спектром антигенов и исключения возможности включения в ее состав возбудителя скрейпи.
Сущность изобретения. Способ получения антирабической вакцины включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства «Щелково-51», инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, и отличается тем, что посевной материала получают в культуре клеток ВНК-21, при этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50, а полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства «Щелково-51» проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38 o С.
Для получения посевного материала полностью исключаются овцы. В результате термообработки в термостабильной популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. Кроме того, эффективность культивирования вируса, прошедшего термическую стадию обработки, значительно выше по сравнению с контролем, что проявляется как в динамике накопления вируса, так и в повышении выхода вируса в целом (увеличивается количество сборов вируса).
Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологичном способе изготовления обладают большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример. Для приготовления вакцины используют культуру перевиваемых клеток ВНК-21, которую получают роллерным способом в виде кругового монослоя в бутылях. В качестве ростовой и поддерживающей питательной среды используют среду на основе среды 199, среды Игла и 10%-ной нативной сыворотки крупного рогатого скота. 2-3-суточный монослой клеток отделяют от поверхности стекла бутылей общепринятым способом, например с помощью версена и трипсина, и ресуспендируют в ростовой среде.
Полученную клеточную взвесь заражают посевным материалом, подготовленным следующим образом: исходный производственный штамм вируса бешенства «Щелково-51» подвергают термообработке до сохранения им инфекционной активности от 0,0001 до 0,001% интрацеребральных мышиных ЛД50.
Для этого первично репродуцированный вирус пассируют в культуре клеток ВНК-21 при температуре 37,5 o С в течение 140-160 ч. Далее вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют в качестве посевного материала для инфицирования и репродуцирования в культуре клеток ВНК-21.
Культивирование осуществляют роллерным способом при температуре 37 o С. Затем проводят сбор вируссодержащей жидкости на 2, 3, 4, 5 и 6 сутки культивирования. Замену ростовой питательной среды проводят после каждого сбора вируса. Начиная с 4-х суток культивирования включение сыворотки крупного рогатого скота в состав питательной среды не требуется. Полученные сборы инактивируют известным способом, например бетапропиолактоном или ДЭИ.
Для изготовления сухих антирабических вакцин к 2-м частям инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют 1 часть среды высушивания.
Для изготовления жидкой антирабической вакцины к инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют адъювант — 6%-ную гидроокись алюминия.
Готовые вакцины проходят биологический контроль на белых мышах по методу NIH (Института здравоохранения США). Индексы иммуногенности вакцин, полученных согласно изобретению, намного выше, чем у вакцин, полученных по известным технологиям. Данные контроля приведены в таблице.
Как видно из таблицы, полученная вакцина имеет высокую иммуногенную активность при более производительном и технологичном способе изготовления.
1. Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала из штамма вируса «Щелково-51», инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличающийся тем, что посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21, при этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения им в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50, а полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что термическую обработку проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38 o С.
QZ4A — Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Красуткин Сергей Николаевич, Мельник Николай Васильевич, Скичко Николай Данилович, Зенов Николай Иванович, Иванов Виктор Серафимович
Лицензиат(ы): ФГУП «ЩЕЛКОВСКИЙ БИОКОМБИНАТ»
Характер внесенных изменений (дополнений):Прекращение действия договора по обоюдному согласию сторон
Номер и год публикации бюллетеня: 12-2004
Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 11.11.2002 № 15471
Извещение опубликовано: 27.04.2004
* ИЛ — исключительная лицензия НИЛ — неисключительная лицензия
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 21.12.2004
QZ4A — Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения
Лицензиар(ы): Открытое акционерное общество «Институт биотехнологий ветеринарной медицины»
Лицензиат(ы): Федеральное государственное предприятие «ЩЕЛКОВСКИЙ БИОКОМБИНАТ»
Характер внесенных изменений (дополнений):Срок действия договора №18591/04 продлен до 04.03.2014
Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 04.03.2004 № 18591
* ИЛ — исключительная лицензия НИЛ — неисключительная лицензия
источник
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антирабической вакцины. Цель изобретения повышение чистоты целевого продукта, а также повышение надежности инактивации вируса. Для осуществления способа штамм вируса бешенства «Внуково 32» выращивают в культуре клеток, собирают вируссодержащую жидкость, инактивируют ее последовательной обработкой ультрафиолетовыми лучами и формалином. Инактивированный вирус подвергают концентрированию и очистке с помощью ультрафильтрации через пористые мембраны и гель-фильтрации на пористых кремнеземах, модифицированных поливинилпирролидоном. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению противовирусных вакцин. Цель изобретения повышение чистоты целевого продукта, а также надежности инактивации вируса. Способ осуществляют следующим образом. Производственный штамм вируса бешенства «Внуково-32» выращивают в культуре первичных клеток почек сирийского хомяка, полученную вируссодержащую культуральную жидкость собирают в бутыли по 15-18 л и для освобождения от клеточного детрита осветляют пропусканием через пористые мембраны с диаметром пор 1900-2000 нм. Осветленную вирусную взвесь инактивируют ультрафиолетовыми лучами в аппарате-иррадиаторе, где расстояние поступающей на вращающийся металлический круг вирусной суспензии от ультрафиолетовых ламп составляет 18 см, скорость вращения круга 20 об/мин. Затем к инактивированной ультрафиолетовыми лучами вирусной взвеси добавляют формалин из расчета 1 мл формалина на 8 л вирусной взвеси, что соответствует концентрации 0,0116-0,0125% взвесь тщательно перемешивают и помещают на 20-22 ч в холодильную камеру при 4 о С. Инактивированную взвесь концентрируют на ультрафильтрационном аппарате с тангенциальным потоком жидкости с площадью фильтрующей поверхности мембран 1 2 м 2 . Диаметр пор мембран 40-60 нм. Давление на внутреннюю поверхность мембран 0,5-0,7 атм. Концентрирование продолжают 1-2 ч до уменьшения объема вируссодержащей жидкости в 45-50 раз. Для удаления вирусных частиц, адсорбировавшихся в пpоцессе концентрирования на внутренней поверхности мембран, в течение 10 мин проводят барботаж, заключающийся в попеременном закачивании в ультрафильтрационный аппарат концентрата и стерильного воздуха, дальнейшее концентрирование жидкости при этом не происходит. Концентрированную вирусную взвесь собирают в сосуд и проводят очистку ее на колонке с пористым кремнеземом МПС-1М-1000, модифицированным поливинилпирролидоном. Используют колонки размером 5,6 х 85 см с 2,1 л кремнезема в трис-фосфатном буфере, рН 7,8. Один цикл гель-фильтрации позволяет очистить 250 мл концентрированной вирусной взвеси и получить 400 мл очищенного пpепарата, содержащего не более 160 мкг/мл примесных белков и имеющего относительную иммуногенность не менее 2,5 МЕ. К полученному очищенному концентрату добавляют человеческий альбумин в трис-НСl буфере до конечной концентрации 0,05% сахарозу до конечной концентрации 7,5% желатозу до 1,0% разливают в ампулы по 1,5 мл и подвергают лиофильной сушке. Сухой препарат хранят при 4 о С. П р и м е р. Изготовление антирабической вакцины серии N 6. Вируссодержащую культуральную жидкость штамма вируса бешенства «Внуково-32», полученную в культуре клеток почек серийского хомяка в объеме 40 л, осветляют путем фильтрации через лавсановые мембраны с диаметром пор 2000 нм, инактивируют в аппарате-иррадиаторе ультрафиолетовых лучей, добавляют 5 мл формалина (конечная концентрация 0,016-0,0125%) и выдерживают в течение 20 ч при 4 о С. Содержание белка 5,6 мг/мл; относительная иммуногенность в опыте на мышах 0,6 МЕ. Концентрирование проводят на ультрафильтрационном аппарате с тангенциальным потоком жидкости с площадью фильтрующей поверхности 2 м 2 . В качестве фильтрующих мембран используют пористые лавсановые фильтры с порами диаметром 40-60 нм. Давление 0,5 атм. Через 2 ч концентриpования объем концентрата доводят до 800 мл (содержание белка 10 мг/мл; относительная иммуногенность 4,09 МЕ), после чего в течение 10 мин проводят барботаж, заключающийся в попеременном закачивании в фильтрационный аппарат концентрата и стерильного воздуха, концентрирование жидкости при этом не происходит. Содержание белка увеличивается до 15 мг/мл; относительная иммуногенность 7,0 МЕ. Очистку концентрированного вируса проводят на колонке с модифицированным поливинилпирролидоном МПС-1М-1000. После трех последовательных циклов гель-фильтрации получают 1200 мл очищенного концентрата, содержащего 140 мкг/мл белка, имеющего относительную иммуногенность на мышах 3,5 МЕ. К полученному очищенному концентрату добавляют человеческий альбумин в трис-НСl буфере до конечной концентрации 0,05% сахарозу до 7,5% желатозу до 1,0% разливают в ампулы по 1,5 мл, замораживают при -60 о С, высушивают по вакуумом. Сухой препарат хранят при 4 о С. Способ обеспечивает получение антирабической вакцины с повышенной надежностью инактивации и высокой иммуногенной активностью. Результаты испытания вакцины приведены в табл.1 и 2.
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ путем выращивания вакцинного штамма вируса бешенства «Внуково-32» в культуре клеток с последующей инактивацией вируссодержащей жидкости ультрафиолетовыми лучами, концентрированием и высушиванием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, концентрирование и очистку вируссодержащей жидкости осуществляют последовательно путем ультрафильтрации через пористые мембраны с диаметром пор 40 60 нм в тангенциальном потоке жидкости, а затем гель-фильтрации на пористых кремнеземах, модифицированных поливинилпирролидоном. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью повышения надежности инактивации вируса, после инактивации ультрафиолетовыми лучами суспензию вируса обрабатывают формалином в конечной концентрации 0,0116 0,0125% от объема суспензии вируса.
MM4A — Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 30.01.2003
источник
Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42 «Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная. Вакцина для профилактики бешенства»
Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42
«Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная. Вакцина для профилактики бешенства»
Данная фармакопейная статья распространяется на вакцину антирабическую культуральную концентрированную очищенную инактивированную, предназначенную для профилактики бешенства.
Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная представляет собой препарат, содержащий штамм фиксированного вируса бешенства «Внуково-32», выращенный в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, концентрированный, очищенный, инактивированный УФ-излучением или УФ-излучением в сочетании с обработкой формальдегидом, лиофилизированный.
Одна прививочная доза вакцины должна содержать вируса бешенства антиген специфический инактивированный в количестве не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ).
Не содержит консервантов и антибиотиков.
Выпускают в комплекте с растворителем — водой для инъекций.
Производственный штамм вируса бешенства
Производство вакцины для профилактики бешенства должно быть основано на системе посевных материалов (seed lot system), включающей главный посевной материал и рабочий посевной материал производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Внуково-32».
Рабочий посевной материал должен пройти не более 5 пассажей, считая от полностью охарактеризованного главного посевного материала.
Для производства вакцины используют вторичный посевной материал без промежуточных пассажей.
Рабочий посевной материал должен отвечать следующим требованиям:
Подлинность . Должен нейтрализоваться иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не должен нейтрализоваться сывороткой крови крупного рогатого скота нормальной. Индекс нейтрализации — не менее 100.
Для испытания параллельно готовят два ряда разведений вируса в диапазоне 1:5-1:50000 с кратностью разведения 10. В качестве среды разведения используют 2% раствор сыворотки крови лошади нормальной, приготовленный с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Для получения разведений вируса в первую пробирку каждого ряда, соответствующую разведению 1:5, вносят 0,4 мл среды разведения, в остальные пробирки ряда по 0,45 мл среды разведения. В первую пробирку каждого ряда добавляют по 0,1 мл восстановленной суспензии вируса бешенства штамм «Внуково-32» и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее готовят ряд последовательных разведений путем переноса 0,05 мл смеси из предыдущей пробирки в следующую пробирку, каждый раз используя новую пипетку. Из последней пробирки, соответствующей разведению 1:50000, удаляют 0,05 мл смеси. В результате конечный объем содержимого каждой пробирки составит 0,45 мл смеси.
В каждую пробирку первого ряда вносят по 0,45 мл иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади, в каждую пробирку второго ряда по 0,45 мл сыворотки крови крупного рогатого скота нормальной, инактивированной при температуре 56°С в течение 30 мин. В результате получают 2 ряда разведений вируса бешенства штамм «Внуково-32» в диапазоне от до . Содержимое пробирок осторожно перемешивают путем встряхивания и инкубируют при температуре °С в течение мин. Затем пробирки быстро охлаждают на льду до комнатной температуры и каждым разведением вируса бешенства в объеме 0,03 мл интрацеребрально заражают по 6 беспородных мышей массой 9-10 г. За животными наблюдают 14 дней. Мышей, павших в течение первых четырех дней, при расчетах не учитывают. Титр вируса, использованного для заражения каждой из двух групп мышей, вычисляют по методу Рида и Менча. Индекс нейтрализации рассчитывают путем вычитания логарифма обратного разведения, соответствующего вируса в смеси с иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади, из логарифма обратного разведения, соответствующего вируса в смеси с сывороткой крупного рогатого скота нормальной. Если полученная разница превышает 2, то индекс нейтрализации больше 100.
Стерильность . Не должен содержать бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, грибов. Микоплазмы должны отсутствовать.
Испытание проводят с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС «Стерильность» методом прямого посева или мембранной фильтрации.
Посторонние вирусные агенты . Не должен содержать посторонних вирусных агентов по результатам испытания на мышах-сосунках, испытания на беспородных белых мышах с массой тела 15-20 г, испытания на морских свинках с массой тела 350-500 г, испытания на культурах клеток.
Инфекционный титр вируса . Не менее при интрацеребральном заражении беспородных белых мышей с массой тела 9-10 г.
Специфическая активность . Не менее 1,0 МЕ.
Определение проводят методом NIH (см. раздел «Испытания готового продукта»).
Для производства вакцины используют первичную культуру клеток почек сирийских хомячков. Почки для получения культуры клеток забирают у клинически здоровых хомячков.
При работе с культурами клеток запрещается использовать антибиотики группы пенициллинов.
Необходимо проводить испытания производственной культуры клеток на стерильность и на отсутствие посторонних вирусных агентов путем изучения феномена гемадсорбции и цитопатических изменений на чувствительных тест-системах: культуре клеток, используемой для производства вакцины, культуре клеточной линии из другого источника, культуре диплоидных клеток человека.
При наличии гемадсорбции и (или) цитопатических изменений в контрольных культурах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии.
Если при повторном исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирус, полученный в соответствующих зараженных культурах, не должен быть использован для производства вакцины.
Все вещества животного происхождения, используемые для получения производственной культуры клеток и культивирования вируса бешенства, проверяют на отсутствие бактерий, грибов, микоплазм и посторонних вирусных агентов. Для размножений клеток не следует применять сыворотки человеческого происхождения.
Основные этапы производства
Все этапы производства должны быть валидированы.
Методы концентрации и очистки вируссодержащей жидкости указывают в частной статье. Допускается концентрация и очистка методом ультрафильтрации или концентрация методом ультрафильтрации с последующей очисткой методом гельхроматографии.
Инактивацию проводят сразу после этапа очистки. При использовании физического метода инактивации отрабатывают режим инактивации: скорость подачи вируссодержащей жидкости, частоту вращения диска инактиватора, интенсивность излучения.
Запрещается использовать в производстве антибиотики после технологического этапа сбора вируссодержащей культуральной жидкости.
В качестве стабилизаторов используют разрешенные вещества. Наименования стабилизаторов указывают в частной статье.
Испытания промежуточных продуктов на этапе производства
Испытание полуфабриката на стерильность проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации, после добавления в вакцину стабилизаторов (испытывают смесь для лиофилизации), в процессе розлива.
Испытание полуфабриката на отсутствие микоплазм проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации.
При использовании дополнительного метода инактивации формальдегидом, в полуфабрикате определяют остаточное количество формальдегида. Содержание формальдегида в полуфабрикате не более 60 мкг/мл.
Испытание полуфабриката на содержание общего белка проводят до добавления стабилизаторов. Содержание общего белка в полуфабрикате от 4,7 до 5,0 мг/мл. Определение проводят в соответствии с ОФС «Общий белок».
По показателю «Герметичность» испытывают все ампулы серии. Для проведения испытания ампулы помещают в кассеты, заполненные водой, подкрашенной любым водно-растворимым красителем. Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы полностью находились в воде. Емкость герметично закрывают и создают в ней избыточное давление, по сравнению с атмосферным, — кПа. Давление выдерживают не менее 15 мин, после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. Емкость открывают, кассеты с ампулами вынимают и просматривают на наличие в них подкрашенной воды. Ампулы, содержащие подкрашенную воду, считают не выдержавшими испытание.
Испытания готового продукта
Описание . Пористая масса белого цвета, гигроскопична. Определяют визуально.
Подлинность . Вакцина должна вызывать специфический иммунитет к вирусу бешенства при иммунизации мышей. Испытание проводят одновременно с испытанием специфической активности. Определение проводят по разделу «Специфическая активность».
Время растворения . Должна полностью растворяться в течение 5 мин при внесении 1,0 мл растворителя (вода для инъекций) на одну дозу вакцины. Определение проводят визуально.
Прозрачность раствора . Прозрачная или слабо-опалесцирующая жидкость, не более эталона I. Определение проводят визуально по ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».
Степень окраски жидкостей . Не более эталона Y4. Определение проводят визуально по ОФС «Степень окраски жидкостей».
Механические включения . Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».
рН раствора. От 7,2 до 7,8. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Потеря в массе при высушивании . Не более 2%. Определяют весовым методом в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».
Альбумин бычий сывороточный (БСА) . Не более 0,5 мкг в дозе. Определяют методом ракетного иммуноэлектрофореза в соответствии с ОФС «Определение бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза».
В качестве антисыворотки допускается использовать сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови рогатого скота адсорбированную кроличью диагностическую для судебно-медицинских целей жидкую. Чувствительность сыворотки определяют предварительно и используют в концентрации, при которой с 0,5 мкг/мл БСА образуется четкая ракета с высотой пика не менее 1 мм.
Стерильность . Должна быть стерильной. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации на тиогликолевой среде в соответствии с ОФС «Стерильность».
Пирогенность . Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Доза препарата для введения составляет одну прививочную дозу, вводимую внутривенно в объеме 1,0 мл.
Аномальная токсичность . Должна быть нетоксичной. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность», раздел «Вакцины и сыворотки». Морским свинкам вводят по 2 мл восстановленной растворителем вакцины подкожно, мышам — по 1 мл восстановленной растворителем вакцины внутрибрюшинно.
Специфическая безопасность . Вакцина не должна содержать живой вирус бешенства.
Для определения специфической безопасности проводят пассаж вакцины в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. В 2 флакона, содержащие питательную среду с гидролизатом лактальбумина (0,5%) в растворе Хенкса для культур клеток, вносят по 200 мл клеточной взвеси, содержащей 300-600 тыс. кл/мл. В среду добавляют 10% сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой.
В качестве контроля используют 2 флакона с незараженной первичной культурой клеток почек сирийских хомячков.
Объем и концентрация клеток, вносимых в опытные и контрольные флаконы, должны быть одинаковыми.
Культуру инкубируют в течение 5-6 сут при температуре °С . Затем отбирают флаконы с полностью сформировавшимся клеточным монослоем. Для испытания на специфическую безопасность от каждой серии отбирают по 25 ампул с препаратом. В каждую ампулу вносят по 1,0 мл растворителя. Восстановленную вакцину объединяют в одну емкость. Из отобранных флаконов с культурой клеток сливают культуральную жидкость. В каждый опытный флакон вносят по 12,5 мл растворенной вакцины, 2 незараженных флакона оставляют как контрольные. Все флаконы инкубируют при температуре °С в течение 90 мин, после чего в опытные и контрольные флаконы вносят по 200 мл питательной среды с гидролизатом лактальбумина (0,5%) в растворе Хенкса для культур клеток. В поддерживающую среду добавляют 5% СКРС и канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл или 4% раствор для инъекций гентамицина сульфата до конечной концентрации 80 мкг/мл. На 7-8 сут инкубации при температуре °С из каждого опытного флакона отбирают по 5,0 мл культуральной жидкости, смешивают пробы и вводят в головной мозг по 0,03 мл смеси десяти беспородным мышам с массой тела от 6 до 7 г.
Аналогично испытывают культуральную жидкость из контрольных флаконов.
За животными наблюдают 21 сут. За весь период наблюдения не должно регистрироваться ни одного случая смерти от бешенства животного, получившего культуральную жидкость из опытных флаконов. Диагноз устанавливают на основании результатов иммунофлюоресценции.
В случае, если в опытной группе зарегистрирована неспецифическая гибель (в первые 4 сут наблюдения) более двух мышей, испытание повторяют.
При появлении хотя бы у одной мыши клинических признаков бешенства (тремор конечностей, атаксия, паралич) или при гибели более двух мышей без клинических признаков заболевания, начиная с 5 сут наблюдения, головной мозг павших животных исследуют методом иммунофлуоресценции. При получении положительных результатов, серию считают не выдержавшей испытания; при получении отрицательного результата проводят повторный контроль на удвоенном количестве образцов вакцины и удвоенном количестве мышей.
В случае отрицательного результата при повторном испытании считают, что вакцина не содержит живого вакцинного вируса бешенства. В случае регистрации при повторном контроле хотя бы у одной мыши клинических признаков бешенства, подтвержденного иммунофлюоресценцией, испытуемую серию вакцины считают не выдержавшей испытания.
Специфическая активность . Не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ) в одной дозе.
Определение специфической активности проводят по методике Национального института здоровья США (NIH). Специфическую активность испытуемой вакцины определяют в сравнении со стандартным образцом специфической активности вакцины антирабической культуральной концентрированной, калиброванным по отношению к Международному стандарту антирабической вакцины. Для определения специфической активности от серии отбирают не менее 3 ампул на каждую иммунизацию.
В каждую ампулу вносят растворитель из расчета 1,0 мл на одну дозу вакцины. Полученные растворы объединяют и готовят ряд разведений с пятикратным интервалом в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625; 1:3125 на 0,9% растворе натрия хлорида или на среде 199, содержащей 0,1% альбумина.
Аналогичным образом готовят разведения стандартного образца, предварительно восстановленного водой для инъекций до содержания 1 МЕ в 1 мл.
Пробирки с разведенной вакциной и стандартным образцом сохранят на льду в течение времени постановки опыта, но не более 4 ч.
В зависимости от предполагаемой величины КР50 (конечное разведение вакцины, защищающее 50% экспериментальных животных), для испытания допускается использовать иной принцип разведения вакцины и стандартного образца, например, в соотношении 1:25-1:3125, 1:25-1:625 и т.д.
Для иммунизации используют мышей линии Balb/c с массой г без различия пола. Каждым разведением вакцины и стандартного образца иммунизируют не менее 11 животных; 40 мышей из этой же партии (контрольная группа) содержат в отдельных клетках до проведения титрования фиксированного вируса бешенства штамм «CVS». Мышей иммунизируют внутрибрюшинно по 0,5 мл 2 раза с интервалом 7 сут. На 7 сут после второй иммунизации вводят фиксированный вирус бешенства штамм CVS интрацеребрально в объеме 0,03 мл шприцем вместимостью 1 . Для заражения всех иммунизированных животных применяют разрешающее (рабочее) разведение вируса бешенства, содержащее от 15 до 50 мл вируса.
Одновременно с заражением иммунизированных мышей на неиммунизированных мышах из контрольной группы проводят титрование фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» для определения точной дозы вируса, взятой в испытание. Для этого используют разрешающее (рабочее) разведение вируса и его десятикратные разведения ( ; ; ) на 2% растворе сыворотки крови лошади нормальной, приготовленном с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Каждым разведением вируса заражают не менее чем по 10 мышей интрацеребрально в объеме 0,03 мл.
За мышами наблюдают в течение 14 сут. При оценке результатов опыта учитывают мышей, заболевших или павших с 5 по 14 сут. При расчете специфической активности по методу Рида и Менча следует учитывать, что количество животных в группах, получивших разные разведения вакцины, на 5 сут должно быть одинаковым (допускается неспецифическая гибель в первые 4 сут после заражения не более одной мыши в группе).
После окончания опыта вычисляют точное количество вируса, содержащееся в 0,03 мл разрешающего разведения, по методу Рида и Менча.
Рассчитывают конечные разведения вакцины и стандартного образца, защищающие 50% животных , по следующей формуле:
где: Т — показатель степени десятичного логарифма
А — логарифм обратной величины разведения, при котором смертность животных ниже 50%;
В — показатель смертности животных ниже 50%;
С — показатель смертности животных выше 50%;
Д — логарифм кратности разведения
Специфическую активность испытуемой вакцины (ОИ) определяют в МЕ относительно специфической активности стандартного образца по формуле:
где: К — величина, обратная испытуемой вакцины;
М — величина, обратная стандартного образца;
У — количество МЕ в 1 мл восстановленного стандартного образца (1 МЕ);
В случае, если при проведении испытания специфическая активность вакцины менее нормативных требований, допускается проведение повторного испытания. Если по результатам повторного испытания специфическая активность менее нормативных требований, то испытание прекращают, а вакцину считают не выдержавшей испытания. Если по результатам повторного испытания специфическая активность соответствует нормативным требованиям, необходимо проведение еще одного испытания. Если по результатам третьего испытания специфическая активность ниже нормативных требований, вакцину считают не выдержавшей испытания; если специфическая активность соответствует нормативным требованиям, вакцину считают выдержавшей испытания.
Термостабильность . Вакцина должна быть термостабильной.
После инкубирования образцов при температуре 37°С в течение 4 недель специфическая активность вакцины должна быть не менее 2,5 МЕ в дозе (см. раздел «Специфическая активность»). Испытанию на «Термостабильность» подвергают не менее двух серий вакцины ежегодно.
Штамм фиксированного вируса бешенства «Внуково-32».
Растворитель, выпускаемый в комплекте с препаратом.
Указывают реквизиты нормативной документации, по которой проводят испытания растворителя.
Упаковка и Маркировка . В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные средства».
Транспортирование . При температуре от 2 до 8°С.
Хранение . В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные средства».
Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
источник