Гам 61 инструкция по применению

Использование: ветеринарная вирусология, в частности новый штамм вируса. Сущность изобретения: штамм вируса ньюкастлской болезни кур депонирован в коллекции вирусов и микроорганизмов ВГНКИ ветеринарных препаратов под N ГАМ-61. Вакцина, изготовленная из штамма Paramyxovirus ГАМ-61 ВГНКИ, безвредна для цыплят 1 — 60-ти дневного возраста. Сохранность среди цыплят яичных пород после ее применения составляет в среднем 99,3%, а среди цыплят-бройлеров — 83,0%. Средний геометрический титр антител в сыворотках крови у данных категорий птицы составляет соответственно . Вакцину, содержащую антиген из штамма Paramyxovirus ГАМ-61 ВГНКИ, используют с профилактической целью против ньюкастлской болезни однократно интраназально, энтерально, внутримышечно или аэрозольно в эффективных дозах. 8 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму Paramixovirus ГАМ-61 ВГНКИ, используемого для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни кур.

Для профилактики и ликвидации ньюкаслской болезни кур (НБ) используют ряд биопрепаратов на основе лентогенных и мезогенных штаммов парамиксовируса I серогруппы. Для лентогенных штаммов этой серогруппы: «В 1 «, «F», «Ла Сота», «Бор-74 ВГНКИ» характерно содержание крупных и нитевидных форм вирусных частиц. Штаммы обладают выраженными гемагглютинирующими свойствами с предельными титрами 1: 512, вызывают образование мелко и среднезернистой реакции гемагглютинации. Предельные инфекционные титры 10 8,0 -10 9,0 ЭИД 50/см 3.

Вакцины, полученные из этих штаммов, иммуногенны, не реактогенны для цыплят, применяются как индивидуальным, так и групповым методами: с водой и аэрозольно. Однако они имеют ряд существенных недостатков:
формируют невосприимчивость не ранее, чем через 2-3 недели после иммунизации; непродолжительный срок иммунитета 3-5 мес. применяют только для профилактики НБ в неблагополучных и угрожаемых хозяйствах.

Мезогенным штаммам парамиксовируса 1 серогруппы, таким как «В» («Роакин»), «МК-107», «Комаров», «Н» и др. присущи основные свойства лентогенных штаммов, но обладают некоторой остаточной вирулентностью: индекс внутримозговой патогенности (ИВМП) находится в пределах 0,50-1,8 0; а величина среднего времени гибели РЭК, вызванная минимальной летальной дозой 72-90 ч.

Вакцины, изготовленные из мезогенных штаммов, высокоиммуногенны, создают невосприимчивость через 48 ч и защищают птицу от заболевания в течение одного года, обрывая начавшуюся эпизоотию. Но в то же время они обладают реактогенностью для цыплят моложе 2-х месячного возраста, вызывая их переболевание с признаками НБ и значительную гибель.

Целью изобретения является получения нового штамма вируса ньюкаслской болезни, обладающего меньшей реактогенностью и высокой иммуногенностью и предназначенного для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни.

Штамм вируса ньюкаслской болезни получен из эпизоотического, выделенного в 1968 году от больной птицы путем перемежающихся последовательных пассажей на гетерогенной культуре клеток почки теленка и куриных эмбрионов с идентификацией в РТГА и РН со специфическими сыворотками против эталонных вакцинных штаммов вирусов НБ, селекцией вариантов по признакам безвредности для цыплят 1-60 суточного возраста, иммуногенности при различных методах аппликации и интенсивности его репродукции в чувствительной системе (куриные эмбрионы).

Штамм вируса ньюкаслской болезни депонирован в коллекции Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный N ГАМ-61.

Штамм Paramyxovirus ГАМ-61 ВГНКИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

При электронноскопическом исследовании штамм «ГАМ-61 ВГНКИ» представлен типичным для парамиксовирусов сферическими и полиморфными скоплениями вирионов округло-овальной формы с пепломерами по всей поверхности мембраны и отдельными частицами филаментозной, округлой и неправильной формы. Матрикс вириона средней электронной плотности, зернистой структуры. Физический титр частиц не превышает 7,6-8,0 мкг/см 3 .

Штамм «ГАМ-61 ВГНКИ» хорошо размножается в 9-10 дневных куриных эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость дозой вируса 10 5,0 Э Л Д 50/0,1 см 3. При этом биологическая активность через 72-96 ч, инкубации при 37 о С достигает значения 10 9,0 -10 9,25 Э Л Д 50/см 3.

В первичных и перевиваемых культурах клеток (ПТ-80, ФЭК, ФЭУ) штамм цитопатического действия не вызывает.

Вирулентные и антигенные свойства.

Штамм «ГАМ-61 ВГНКИ» при интрацеребральном введении суточным цыплятам в дозе 0,05х 10 8,0 Э Л Д 50/см 3 вызывает их клиническое переболевание и гибель в течение 5-7 дней. Внутривенное введение вируса в дозе 10 8 Э Л Д 50/см 3 приводит только к переболеванию НБ 40-дневных цыплят в течение 5-10 дней.

Индекс внутримозговой патогенности (ИВМП) 1,5.

Индекс внутривенной патогенности (ИВВП) меньше 1,0.

Величина среднего времени гибели, вызванная минимальной летальной дозой (СВГ/МЛД) 72-90 ч.

Штамм «ГАМ/61 ВГНКИ» антигенно родственен парамиксовирусу первой антигенной подгруппы (ПМВ-1).

При введении в организм птиц вызывает формирование клеточного и гуморального иммунитета. Вируснейтрализующие и антигемагглютинирующие антитела накапливаются в титрах 3,0-8,0 лог 2 . Клеточный иммунитет, оцениваемый по уровню Т-лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования, формируется к окончанию 1 недели после вакцинации на фоне низкого уровня антигемагглютининов. Цыплята, однократно привитые вакциной из штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» интраназально, перорально, внутримышечно, аэрозольно через 48-72 ч и через 14 дней были иммунны в 100% случаев.

Абсолютная невосприимчивость вакцинированной птицы при интраназальном методе введения в дозе 10 5,0 Э Л Д 50 , при энтеральном 10 6,0 Э Л Д 50 , при внутримышечном 10 6,0 Э Л Д 50 , при аэрозольном 800 Э Л Д 50 для цыплят; 1600 Э Л Д 50 для взрослой птицы.

Штамм «ГАМ-61 ВГНКИ» вируса НБ обладает способностью агглютинировать эритроциты птиц и животных, гемагглютинирующий титр 1:512. Реакция гемагглютинации мелкозернистая, элюция вируса через 10-15 мин.

Выраженным тропизмом штамм не обладает, хотя имеет тенденцию к преимущественному размножению в клетках головного мозга и селезенке, накапливаясь в титрах 4,25-7,55 lg Э Л Д 50/см 3. Длительный период обнаружения вируса в трахее и помете свидетельствует об аэрогенном и алиментарном путях распространения штамма.

Штамм «ГАМ-61 ВГНКИ» вируса НБ безвреден для цыплят всех возрастных групп при энтеральном и парентеральном введении в 10-100 кратной профилактической дозе, не способен к реверсии, не вызывает заболевания и гибели кроликов, белых мышей, морских свинок и белых крыс.

П р и м е р 1. Вирулентность штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» определяют по индексам патогенности для восприимчивых цыплят при внутримозговой и внутривенной инокуляции вируса и тесту эмбриональной чувствительности.

Индекс внутримозговой патогенности штамма (ИВМП) определяют на двух группах суточных СПФ-цыплятах, которым вводят культуры вакцинных штаммов «ГАМ-61 ВГНКИ» и «Н». Вирусы в дозе 10 8,0 Э Л Д 50/0,05 см 3 инъецируют в правое полушарие головного мозга. Группе контрольных цыплят в том же объеме (0,05 см 3 ) интрацеребрально вводят физиологический раствор. Срок наблюдения 8 дней. В результате у цыплят, зараженных культурой штамма «Н», на вторые сутки отмечают угнетение, затрудненное дыхание с открытым клювом, дрожание головы и гибель через 48-72 ч.

У цыплят, инфицированных штаммом «ГАМ-61 ВГНКИ», проявление аналогичных клинических признаков заболевания наступает на 4-е сутки и гибель через 5-7 дней. При вскрытии у павшей птицы обнаруживают признаки энтерита, гастрита, кровоизлияний в бифуркации и на границе между мышечным и железистым желудком.

Индекс внутримозговой патогенности рассчитывают по методу Хансона. Расчетный ИВМП для шт. «ГАМ-61 ВГНКИ» и контрольного шт. «Н» составляют соответственно 1,5 и 1,8, что свидетельствует с принадлежности штаммов к группе мезогенных вирусов.

П р и м е р 2. Индекс внутривенной патогенности (ИВВП) определяют на 40-дн. цыплятах, полученных из хозяйств, где птица не вакцинируется против НБ. Культуру штамма вируса «ГАМ-61 ВГНКИ» вводят в правую подкрыльцовую вену в дозе 10 8,0 Э Л Д 50/0,1 см 3. Контролем служат две группы цыплят-аналогов, которым внутривенно вводят физиологический раствор и культуру штамма вируса НБ «Н» в дозе 10 8,0 Э Л Д 50/0,1 см 3.

Устанавливают: у цыплят, зараженных культурой штамма «Н», признаки заболевания проявляются через 48 ч и отмечают на протяжении 5-ти суток гибель 40% птицы. У цыплят, инфицированных шт. «ГАМ-61 ВГНКИ», признаки заболевания проявляются лишь на 5-е сутки и переболевание продолжается в течение 8 суток (срок наблюдения).

Индекс внутривенной патогенности: (ИВВП), рассчитанный по методу Хансона для «ГАМ-61 ВГНКИ» и «Н» составил соответственно 1.

Таким образом: штамм вируса «ГАМ-61 ВГНКИ» по данному критерию в большей степени соответствует группе лентогенных вирусов.

П р и м е р 3. Определяют вирулентность штамма вируса «ГАМ-61 ВГНКИ» в тесте эмбриональной чувствительности по среднему времени гибели РЭК, вызванной минимальной летальной дозой вируса (СВГ/МЛД).

Для этого готовят серию 10-ти кратных разведений исследуемого вируса (10 -1 -10 -10 ), пять из них (10 -1 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 , 10 -10 ) используют для заражения 10-ти дневных куриных эмбрионов (КЭ) в аллантоисную полость в объеме 0,1 см 3 . Наблюдение проводят 2 раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Регистрируют, а затем суммируют величину времени гибели эмбрионов от минимальной дозы, находят ее среднюю величину делением на количество погибших эмбрионов. Величина СВГ/МЛД 72-90 ч для данного штамма соответствует параметрам вирусов мезогенной группы.

П р и м е р 4. Антигенную активность штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» изучают в лабораторных опытах по уровню формирования гуморального иммунитета, т.е. по способности штамма индуцировать образование специфических антигемагглютининов.

60 голов 30-ти дневных цыплят иммунизируют внутримышечно, энтерально культурой вируса в дозе 10 7,0 ЭЛД 50 в объеме 0,2; 0,5 см 3 соответственно. До постановки опыта (для определения материнского иммунитета) и на 7, 14, 21 сутки после прививки от 10 голов каждой группы птиц, иммунизированных определенным методом, получают сыворотки крови и исследуют в РТГА с 0,7%-ным раствором эритроцитов петуха, определяя уровень специфических антител к вирусу НБ.

Контролем служат 60 голов цыплят того же возраста, вакцинированные культурой штамма «Н» в тех же дозах.

Динамика образования антигемагглютининов, индицируемых штаммами «Н» и «ГАМ-61 ВГНКИ», представлена в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что оба штамма, использованные для иммунизации цыплят, при внутримышечном и энтеральных методах введения обеспечивают образование высокого уровня антител, но при иммунизации культурой штамма «Н» у цыплят отмечают сильную поствакцинальную реакцию: отказ от корма, сильное отставание в росте и развитии. Применение же штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» поствакцинальных осложнений не вызывает.

Для подтверждения надежности иммунитета, создаваемого штаммами «Н» и «ГАМ-61 ВГНКИ» птицу, прошедшую серотест, подвергают контрольному заражению высоковирулентным штаммом «Т-53» вируса ньюкаслской болезни в дозе 1000 Л Д 50/0,2 см 3 на 7, 14 и 21 сутки.

Результаты контрольного заражения представлены в табл. 2.

Из табл. 2 следует, что иммунизация цыплят 30-дневного возраста культурой штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» обеспечивает, по сравнению с аналогичным применением культуры штамма «Н», наиболее высокую степень защиты поголовья при его контрольном заражении вирулентным штаммом «Т-53» (выживаемость 93,3-100%).

П р и м е р 5. Изучают антигенную активность штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» в лабораторных условиях по уровню формирования клеточного и гуморального иммунитета при интраназальной иммунизации.

Для этого цыплятам 30-дневного возраста опытной группы интраназально вводят культуру штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» в дозе 10 7,0 ЭЛД 50 в объеме 0,1 см 3 . Контрольную группу не прививают. Титр материнских антител 2,0-2,4 лог 2 .

На 7, 14, 21 сутки от 10 цыплят опытной и контрольной групп берут кровь для параллельного определения: в крови уровня Т- лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования, а в сыворотке крови уровня специфических антител в реакции торможения гемагглютинации.

Одновременно со взятием крови птицу заражают высоковирулентным штаммом «Т-53» для подтверждения надежности создаваемого иммунитета.

Динамика формирования гуморального и клеточного иммунитета у цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61 ВГНКИ», представлена в табл. 3.

Данные табл. 3 показывают, что при интраназальном методе иммунизации культурой штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» у птицы на 7 сутки формируется недостаточно напряженный гуморальный иммунитет, что компенсируется в эти сроки выработкой необходимого количества ответственных за клеточный иммунитет Т-лимфоцитов, способствующих высокой степени защиты поголовья к контрольному заражению вирулентным штаммом «Т-53» вируса НБ.

П р и м е р 6. Иммуногенность вакцинного штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» оценивают на 180 цыплятах 15-17 дневного возраста, которых прививают различными способами с последующим их инфицированием через 14 дней культурой высоковирулентного штамма «Т-53» ВНБ в дозе 10 3,0 Э Л Д 50/0,2 Контрольных цыплят не прививают.

Результаты проверки иммунногенности штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, все опытные цыплята, вакцинированные вирусом «ГАМ-61 ВГНКИ» различными методами, после контрольного заражения оказались абсолютно устойчивыми при 100% гибели контрольных, что свидетельствует о высокой иммуногенности штамма.

П р и м е р 7. В острых камеральных и производственных опытах на 25-дневных цыплятах и взрослых курах определяют эффективную иммунизирующую дозу штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» вируса НБ.

Серийными разведениями штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» в дозах 10 7,0 10 1,0 ЭЛД 50 прививают интраназально, перорально, внутримышечно, а аэрозольно в дозах от 400 до 1600 ЭЛД 50 группы подопытных птиц и через 14 дней заражают вирулентным штаммом вируса НБ «Т-53» в дозе 1000 Л Д 50/0,2 см 3.

Результаты опытов представлены в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что использование вируссодержащей жидкости из штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» вызывает невосприимчивость у 100% вакцинированной птицы при интраназальном методе введения в дозе 10 5,0 Э Л Д 50/0,1 см 3. при энтеральном 10 6,0 Э Л Д 50/10,0 см 3 при внутримышечном 10 6,0 Э Л Д 50/0,5 см 3 при аэрозольном 800 ЭЛД 50 для цыплят
1600 ЭЛД 50 для взрослой
птицы.

П р и м е р 8. Изучают репродуктивную способность штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» в организме птицы на СПФ-цыплятах 30-дневного возраста, которых прививают внутримышечно культурой штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» в дозе 0,2х10 7,0 Э Л Д 50/см 3. Через 3, 5, 7, 10, 30 дней от 10-ти цыплят отбирают пробы для вирусологических исследований и определяют в них наличие вируса методом титрования на КЭ.

Динамика выделения вакцинного штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» вируса НБ из внутренних органов привитых цыплят представлена в табл. 6.

Как видно из табл. 6, вирус реизолируется из всех исследуемых материалов с 3 по 9 день после заражения. Через 7 дней после иммунизации интенсивность репродукции штамма достигает максимума (суммарная инфекционная активность выделенного вируса 19,4 лог.). Подавляющее его количество находят в головном мозге (7,65 лог), что свидетельствует о проявлении признаков нейтротропности, характерной для представителей велогенной группы ньюкаслских вирусов.

Данные табл. также показывают, что распространение вакцинного вируса среди восприимчивого поголовья может осуществляться как воздушно-капельным, так и фекально-оральным путем.

П р и м е р 9. Изучают способность штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» сохранять исходную степень аттенуации на 10 суточных СПФ цыплятах, путем последовательных 10-кратных пассажей вируссодержащего материала. Аллантоисную жидкость, содержащую культуру штамма «ГАМ-61 ВГНКИ», вводят цыплятам внутримышечно в дозе 10 7,0 Э Л Д 50/0,2 Через 7 дней цыплят убивают, отбирают пробы головного мозга, готовят 10% суспензию, в которой определяют количество вируса методом титрования на КЭ и используют для инфицирования следующей партии цыплят.

Результаты изучения реверсибельности штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» представлены в табл. 7.

Как видно из табл. 7 многократное пассирование штамма на чувствительной биологической модели свидетельствует с его высокой стабильности и неспособности к реверсии в вирулентную форму.

П р и м е р 10. Вакцину готовят следующим образом: хорошо развитые 9-дневные эмбрионы кур заражают культурой штамма вируса «ГАМ-61 ВГНКИ» в аллантоисную полость в дозе 10 4 -10 5 Э Л Д 50/0,1 см 3. Павшие эмбрионы после 72-96 ч инкубации в течение 4 ч охлаждают при 4 о С, а затем выдерживают при комнатной темпеpатуре в течение 2-3 ч до испарения конденсата. В условиях асептики эмбрионы вскрывают, собирают экстраэмбриональную жидкость с последующим ее контролем на стерильность, биологическую активность вируса. Экстраэмбриональную жидкость штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» с биологической активностью не ниже 10 8,5 ЭЛД 50 смешивают с защитной средой из расчета 1-1-2, добавляют антибиотики, преимущественно пенициллин и стрептомицин по 100-200 ЕД/см 3 и шуттелируют в течение 10-15 мин.

После шуттелирования вируссодержащую вакцинную суспензию разливают в стерильные ампулы по 1; 2 см 3 или во флаконы по 3 см 3 . Ампулы и флаконы с препаратом немедленно закрывают двухслойной марлевой салфеткой или стерильно гигроскопической ватой, которые промораживают в низкотемпературных аппаратах при температуре 40-50 о С в течение 6-10 ч. Быстро загружают замороженную вакцину в стерильные вакуум-камеры, где ее лиофильно высушивают до достижения влажности 2-3%
По окончании лиофилизации в асептических условиях проводят запайку ампул и закатку флаконов колпачками с последующим контролем всех изготовленных серий вакцины на стерильность, безвредность, иммуногенность, остаточную влажность.

Готовая вакцина представляет собой сухую мелко-пористую массу серо-желтого цвета в виде таблетки, не рассыпающейся при встряхивании. Биологическая активность не ниже 10 8,0 Э Л Д 50/0,1 см 3.

П р и м е р 11. Вакцину, содержащую в основе экстраэмбриональную жидкость из штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» с биологической активностью 10 8,0 Э Л Д 50/ см 3, приготовленную по примеру 9, вводят в организм подопытных групп цыплят 15-25 дн. возраста с профилактической целью против ньюкаслской болезни однократно интраназально, энтерально, внутримышечно и аэрозольно в эффективных дозах. Сроки ревакцинации определяют по показаниям РТГА.

Эффективность каждой вакцинации контролируют через 7 дней серологическими исследованиями сыворотки крови в РТГА и путем заражения цыплят культурой вирулентного штамма НБ «Т-53» в дозе 1000 ЭЛД 50 .

Результаты иммунизации цыплят штаммом «ГАМ-61 ВГНКИ» представлены в табл. 8.

Как видно из табл. 8 иммунизация птицы вакциной, содержащей в основе антиген из штамма вируса «ГАМ-61 ВГНКИ», обеспечивает надежную защиту цыплят от заражения высоковирулентным штаммом «Т-53» вируса ньюкаслской болезни.

П р и м е р 12. Вакцину против НБ с биологической активностью 10 8,0 Э Л Д 50/ см 3 испытывают в птицеводческих хозяйствах неблагополучных по НБ с профилактической целью.

Вакцину вводят 1 млн, голов цыплят яичных пород 65-70 дневного возраста внутримышечно в дозе 10 6,0 ЭЛД 50/мл в объеме 0,5-1,0 мл и 8,1 млн. голов 12-17 дневных цыплят-бройлеров аэрозольно в дозе 600-800 Э Л Д 50/ см 3 после предварительной иммунизации аналогичными препаратами из лентогенных штаммов («Ла Сота», «Бор-74 ВГНКИ»). Учитывают результаты сохранности. Проводят серологическое исследование сывороток крови через 14 дней после вакцинации в РТГА.

Сохранность среди цыплят яичных пород после применения вакцины на основе антигена из штамма «ГАМ-61 ВГНКИ» составляет в среднем 99,3% а среди цыплят-бройлеров 83,0% Средний геометрический титр антител у цыплят-бройлеров 7,6 log 2 ; у цыплят яичных пород 6,4 log 2 , что свидетельствует о достаточно напряженном иммунитете.

Проведенные исследования и испытания показывают, что полученный штамм Paramixovirus «ГАМ-61 ВГНКИ» высокоиммуногенен, безвреден для цыплят 1-60 дневного возраста, что позволяет рекомендовать его для изготовления эффективного биопрепарата против ньюкаслской болезни.

Экономический эффект от использования штамма для получения вакцины против ньюкаслской болезни будет складываться за счет расширения арсенала высокоэффективных биопрепаратов, снижения затрат на проведение профилактических мероприятий.

Штамм Paramyxovirus ВГНКИ ГАМ-61, используемый для изготовления вакцины против ньюкастлской болезни кур.

источник

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация, — 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Руденко, Татьяна Владиславовна. Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» : диссертация . кандидата биологических наук : 03.00.06.- Москва, 2000.- 198 с.: ил. РГБ ОД, 61 01-3/120-3

1.1. Актуальность темы. В условиях специализированных птицеводческих хозяйств первостепенное значение принадлежит иммунопрофилактике инфекционных болезней вирусной этиологии. Высокая концентрация поголовья на ограниченных территориях, одновременное содержание неоднородных по возрасту и физиологическому развитию птиц, использование кормов, обсемененных болезнетворными агентами, постоянное поступление ремонтного молодняка из эпизоотически опасных хозяйств и регионов, создают благоприятные условия для быстрого возникновения и распространения инфекционных болезней, оперативная профилактика и ликвидация которых невозможны без применения современных иммунологических препаратов (Alexander D.J., 1980,1987,1995).

Одной из наиболее опасных инфекций является ньюкаелская болезнь (НБ). Несмотря на обстоятельные исследования в области эпизоотологии НБ, расшифровку молекулярных основ патогенности возбудителя, наличия детально отработанных методов диагностики и профилактики, это заболевание до настоящего времени является актуальным не только для птицеводства стран, стационарно неблагополучных по НБ, но и для европейских государств, многие годы свободных от высоковирулентных вариантов возбудителя (World Animal Health, 1996,1997).

По данным Международного Эпизоотического Бюро в 1996 г. в мире официально зарегистрировано 2277 неблагополучных по НБ пункта, в 1997 г-2382, в 1998 г-2385. В последнее время на некоторых континентах начала прослеживаться тенденция их увеличения. Так, в Европе после крупной эпизоотии НБ в 1993-94 гг. (390 зарегистрированных неблагополучных пунктов только в Германии) в 1996 г. было зафиксировано 69 случаев возникновения нькжаелской болезни, в 1997-98 гг.—98.

В Российской Федерации за период 1996-2000 гг. было отмечено всего лишь 13 пунктов, где заболевание проявлялось клинически. Однако, заметно увеличилось количество хозяйств с атипичным течением НБ, о наличии которой можно судить только по обнаружению чрезвычайно высоких титров антител, снижению общей сохранности и продуктивности. По мнению ряда ученых, одной из возможных причин, объясняющих данную ситуацию, является изменение антигенной или конформационной структуры вирулентных штаммов вируса НБ, что неизбежно при длительном направ-

ленном антительном прессинге (Collins M.S., Strong I., Alexander D.J.,1994). Следствием этого является неполная комплементарность измененного вируса антителам, формирующимся в ответ на введение большинства традиционных профилактических препаратов, предложенных более 40-50 лет назад и до настоящего времени производящихся отечественной биологической промышленностью (Alexander D.J., 1981,1988,1997).

Поэтому с научной и практической точек зрения представлялась важной и своевременной разработка нового профилактического препарата из вакцинного штамма НБ максимально «поздней» селекции. Такой штамм, обозначенный «ГАМ-61» («А(в)ВН») был получен в начале 70-х годов сотрудником ЦВЛ Михальским Г.А. путем аттенуа-ции на первичной культуре клеток почки теленка и эмбрионах кур высоковирулентного вируса НБ, выделенного от павших 25-ти суточных цыплят птицефабрики «XXII партсъезда» Луховицкого района Московской области. При этом основные иммунобиологические свойства штамма были не изучены.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось создание вакцины
против ньюкаслской болезни, отвечающей современным требованиям, предъявляе
мым к противовирусным биологическим препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Изучить иммунобиологические свойства штамма «ГАМ-61», предлагаемого в качестве продуцента новой вакцины.

Проверить эффективность вакцины в лабораторных и производственных условиях.

Разработать технологию изготовления вирусвакцины, методы ее контроля, подготовить нормативную документацию (НД).

1.3. Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

Определены генетические параметры и иммунобиологические характеристики штамма «ГАМ-61» вируса НБ, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, и предложен для производства вакцины.

Изучен механизм формирования ранней резистентности цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61».

Разработан новый метод контроля иммуногенности профіиіактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием рефе-ренс-серий вакцин.

Установлена структурная и филогенетическая близость искуственно-аттенуированных мезогенных штаммов «ГАМ-61» и «Н» с высоко вирулентными изолятами віфуса ньюкаслской болезни (ВНБ). Доказано, что последовательность нуклеотидных оснований и аминокислотных остатков в сайте разрезания FO-белка вирусов НБ детерминирована, что позволяет дифференцировать штаммы по степени их патогенности. Снижение вирулентности штаммов ВНБ в процессе аттенуации не связано с нуклеотиднымн заменами в функционально важных участках генов F и HN.

Новизна полученных результатов подтверждена патентом РФ на изобретение: «Штамм Paramyxovirus, используемый для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни кур». Патент РФ № 2055890 от 10.03.96т.

1.4. Практическая значимость. Подготовлена и утверждена в установленном порядке нормативная документация на «Вирусвакципу против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» сухую» (Технические условия 9384-080-95 от 25.12.95 г. и Наставление по применению вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» № 13-4-2/490 от 27.12.95 г.). Разработана инструкция по изготовлению и контролю вакцины (утверждена директором ВГНКИ 12.1995 г.).

Вакцина из штамма «ГАМ-61» зарегистрирована в РФ и выпускается серийно по заявкам потребителей во ВНИИТиБП и на Краснодарской биофабрике.

Разработаны «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХи П РФ 23.06.97 г.

Метод оценки иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием референс-серий вакцин введен в ТУ № 9384-080-95 от 25.12.95 г. «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; ТУ 46-21-567-80 «Вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма «БОР-74 ВГНКИ»; ТУ 9384-010-00008064-98 «Вирусвакцина сухая

6 против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакщша сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота». 1.5. Апробация. Материалы диссертации доложены на XIII научной конференции молодых ученых (10.01.1992), на 11-ом Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгрия, 1997), на 10-ой Европейской конференции по птицеводству (Израиль, 1998), а также на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней, Ученого Совета ВГНКИ.

Разработки по материалам диссертации удостоены медали «Лауреат ВВЦ» (постановление № 2345 от 12.98 г.).

1.6. ТІубликашш. Основные положения диссертационной работы отражены в двух
заключительных отчетах ВГНКИ: за 1991-1993 гг. № Гос. регистрации 01910034974; за
1994-1996 гг. № Гос. регистрации 01940007075; в комплекте НД на вакцину против
ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61», а также в 15 научных статьях, включая
Патент РФ на изобретение, и «Методические указания по определению уровня антител
к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Результаты изучения биологических свойств штамма «ГАМ-61» в сравнении со штаммом «Н» вируса НБ.

Технология изготовления и контроля вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61».

Методики и результаты разработки количественных показателей оценки иммуно-генности вакцин против ньюкаслской болезни.

Результаты испытания эффективности вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61» в лабораторных и производственных условиях.

Результаты исследований функционально важных участков генома вируса НБ для определения антигенных модификаций полевых возбудителей и изучения молекулярных основ процесса аттенуации штамма «ГАМ-61».

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 498 страницах
машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и мето
ды, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические пред
ложения, список литературы и приложения.

источник

Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Руденко, Татьяна Владиславовна

1.1. Общие сведения о нькжаслской болезни.12

1.1.1. Клинические признаки и формы проявления.17

1.1.2. Патологоанатомические изменения

1.2. Биологические свойства вируса ньюкаслской болезни

1.2.1. Таксономическое положение, антигенный и химический 21-23 состав вируса

1.2.3. Выделение и методы культивирования вируса.24

1.2.3.1. Способность вируса к репродукции при различной температуре.25

1.2.3.2. Способность вируса к репродукции в культурах клеток.26

1.2.4. Аттенуация вирулентных штаммов вируса ньюкаслской болезни.27

1.2.5. Гемагглютинирующая активность.30

1.2.6. Нейраминидазная активность.

1.2.7. Интерфероногенная активность и интерферирующая спо- 31-33 собность.

1.2.10. Антигенные свойства вируса.35

1.2.11. Вирулентность и основы патогенности .36

1.3. Иммунная система птиц.38

1.3.1. Иммунитет при ньюкаслской болезни.

1.3.1.1. Клеточно-опосредованный иммунитет. Краткая хг 40-43 иммунокомпетентных клеток.

1.3.1.2. Гуморальный иммунитет.43

1.3.1.3. Локальный иммунитет.45

1.4. Средства специфической профилактики ньюкаслской болезни.

1.4.1. Вакцины из лентогенных штаммов .46

1.4.2. Вакцины из мезогенных штаммов .51

1.4.3. Инактивированные вакцины.53

1.4.4. Генно-инженерные вакцины.55

Вакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма «КБК» 2004 год, кандидат биологических наук Алиева, Айзанат Кадыровна

Технологии промышленного производства культуральных вакцин против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни 2001 год, доктор биологических наук Соловьев, Борис Васильевич

Вакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма «Винтерфилд 2512» 2002 год, кандидат биологических наук Норкина, Светлана Николаевна

Иммунобиологические свойства бирнавируса птиц и разработка средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни 2011 год, доктор биологических наук Алиева, Айзанат Кадыровна

Биологические свойства вакцинного штамма «СТ», технология его получения и использование против инфекционной бурсальной болезни кур 2006 год, доктор ветеринарных наук Годизов, Петр Харитонович

Актуальность темы. В условиях специализированных птицеводческих хозяйств первостепенное значение принадлежит иммунопрофилактике инфекционных болезней вирусной этиологии. Высокая концентрация поголовья на ограниченных территориях, одновременное содержание неоднородных по возрасту и физиологическому развитию птиц, использование кормов, обсеменных болезнетворными агентами, постоянное поступление ремонтного молодняка из эпизоотически опасных хозяйств и регионов, создают благоприятные условия для быстрого возникновения и распространения инфекционных болезней, оперативная профилактика и ликвидация которых невозможны без применения современных дммунологи-ческих препаратов (129,143,146,149).

Одной из наиболее опасных инфекций является ньюкаслская болезнь (НБ). Несмотря на обстоятельные исследования в области эпизоотологии НБ, расшифровку молекулярных основ патогенности возбудителя, наличия детально отработанных методов диагностики и профилактики, это заболевание до настоящего времени является актуальным не только для птицеводства стран, стационарно неблагополучных по НБ, но и для европейских государств, многие годы свободных от высоковирулентных вариантов возбудителя (329,330).

По данным Международного Эпизоотического Бюро в 1996 г. в мире официально зарегистрировано 2277 неблагополучных по НБ пункта, в 1997 г. — 2382, в 1998 г. — 2385. Причем, в последнее время на некоторых континентах вновь начала прослеживаться тенденция их увеличения. Так, в Европе после крупной эпизоотии НБ в 1993-94 гг. (390 зарегистрированных неблагополучных пунктов только в Германии) в 1996 г. было зафиксировано 69 случаев возникновения ньюкаслской болезни, в 1997- 98 гг.-98.

В РФ за период с 1996 г. по 2000 г. было отмечено всего лишь 13 пунктов, где заболевание проявлялось клинически (307,329). Однако заметно увеличилось количество хозяйств с атипичным течением НБ, о наличии которой можно судить только по появлению чрезвычайно высоких титров антител, снижению общей сохранности и продуктивности. По мнению ряда ученых, одной из возможных причин, объясняющих данную ситуацию, является изменение антигенной или конформационной структуры вирулентных штаммов вируса НБ, что неизбежно при длительном направленном антительном прессинге (202). Следствием этого является неполная комплементарность измененного вируса антителам, формирующимся в ответ на введение большинства традиционных профилактических препаратов, предложенных более 40-50 лет назад и до настоящего времени производящихся отечественной биологической промышленностью (129,130,145,150) .

Поэтому с научной и практической точек зрения представлялась важной и своевременной разработка нового профилактического препарата из вакцинного штамма НБ максимально «поздней» селекции. Такой штамм, обозначенный «ГАМ-61» («А(в)ВН») был получен в начале 70-х годов сотрудником ЦВЛ Михальским Г.А. путем аттенуации на первичной культуре клеток почки теленка и эмбрионах кур высоковирулентного вируса НБ, выделенного от павших 25-ти суточных цыплят птицефабрики «XXII партсъезда» Луховицкого района Московской области. При этом основные иммунобиологические свойства штамма были не изучены.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось создание новой вакцины против ньюкаслской болезни, отвечающей современным требованиям, предъявляемым к противовирусным биологическим препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить иммунобиологические свойства пггамма «ГАМ-61», предлагаемого в качестве продуцента новой вакцины.

• Проверить эффективность вакцины в лабораторных и производственных условиях.

• Разработать технологию изготовления вирусвакцины, методы ее контроля, подготовить НД.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

• Определены генетические параметры и иммунобиологические характеристики штамма «ГАМ-61» вируса НБ, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, и предложен для производства вакцины.

• Изучен механизм формирования ранней резистентности цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61».

• Разработан новый метод контроля иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием референс-серий вакцин.

• Установлена структурная и филогенетическая близость искуственно-аттенуированных мезогенных штаммов «ГАМ-61» и «Н» с высоко вирулентными изолятами ВНБ. Доказано, что последовательность нуклеотидных оснований и аминокислотных остатков в сайте разрезания Fo-белка вируса НБ детерминирована. Это позволяет дифференцировать штаммы по степени их патогенности. Снижение вирулентности в процессе аттенуации не связано с нуклеотидными заменами в функционально важных участках генов F и HN.

Практическая значимость. Подготовлена и утверждена в установленном порядке нормативная документация на «Вирусвакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» сухую» (Технические условия 9384-080-95 от 25.12.95 г. и Наставление по применению вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» № 13-4-2/490 от 27.12.95 г.). Разработана инструкция по изготовлению и контролю вакцины (утверждена директором ВГНКИ 12.1995 г.).

Метод оценки иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием референс-серий вакцин введен в ТУ 9384-080-95 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; ТУ 9384-002-22727671-00 «Вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма «БОР-74 ВГНКИ»; ТУ 9384-010-00008064-98 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота».

Апробация. Материалы диссертации доложены на XIII научной конференции молодых ученых (10.01.1992 г.), на 11-ом Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгрия, 1997), на 10-ой Европейской конференции по птицеводству (Израиль, 1998), а также на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней, Ученого Совета ВГНКИ.

Разработки по материалам диссертации удостоены медали «Лауреат ВВЦ» (постановление № 2345 от 12. 98 г.).

Публикации. Основные положения диссертационной работы отражены в двух заключительных отчетах ВГНКИ: за 1991-1993 гг. № Гос. регистрации 01910034974; за 1994-1996 гг. № Гос. регистрации 01940007075; комплекте НД на вакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; а также в 15 научных статьях, включая Патент РФ на изобретение, и «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• Результаты изучения биологических свойств штамма «ГАМ-61» в сравнении со штаммом «Н» вируса НБ.

• Технология изготовления и контроля вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61».

• Методики и результаты разработки количественных показателей оценки иммуногенности вакцин против ньюкаслской болезни.

• Результаты испытания эффективности вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61» в лабораторных и производственных условиях.

• Результаты исследований функционально важных участков генома вируса НБ для определения антигенных модификаций полевых возбудителей и изучения молекулярных основ процесса аттенуации штамма «ГАМ-61».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 19& страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

Совершенствование технологии производства и способов применения вакцин против ньюкаслской болезни 2010 год, доктор биологических наук Скотникова, Татьяна Анатольевна

Разработка средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней 2008 год, доктор ветеринарных наук Кукушкин, Сергей Анатольевич

Сравнительное изучение эффективности различных вакцин и методов вакцинации цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни 2002 год, кандидат ветеринарных наук Амдемариям, Герма Гебремариям

Разработка культуральной вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц 2004 год, кандидат ветеринарных наук Орлов, Александр Александрович

Антигенные свойства средств специфической профилактики ортомиксо- и парамиксовирусных инфекций у голубей 2011 год, кандидат биологических наук Зотова, Зоя Витальевна

Полученные результаты свидетельствуют отом, что вакцина из штамма «ГАМ-61» является эффективным противоэпнзоотнческим препаратом для хозяйств, стационарно неблагополучных по НБ, и позволяют надежно контролировать эпизоотическую ситуацию .

Систематическое применение вакцины из штамма « ГАМ-61» способствует вытеснению из стада вирулентных возбудителей НБ и оздоровлению поголовья от данного заболевания.

И-ДСуровцева И.П.Горева Т.В.Руденко ‘ Ю.В.Родин

Краснодарский птицепром 24 сентября 1993 год

Заключительный акт по результатам испгтаяи;: в Краснодарском к’оао опытно -лоо-шшлешшх серий вирусвакципы против» ишодслодо»; болозш» из штак;,а»А(в)Б1Г1 в течение 1993 года. гласпо разрешения Главного Управления ветеринарии от 07.05.92г. •46/442 в условиях птицефабрик Краснодарского края в 1393 году >дилнсъ испытания опытно -проглышлеиных серий вирусвакцины против злско:] болезни из шташла «А (в )ШГ’. зкцияа была изготовлена согласно требованиям Временной инструкции

•отовленкю к контролю сухой вирусвакципы из штаглма»А(в)ВН» , утгор;.

1\ директором НИЖИ ветпрепаратов 20.03.92г. ятрэль вакцины проводив согласно Т требованиям ТУ на вакцину, дащш-ТУВ КСХ РФ 07.05.92 г., а выпускали по. результауагл порчтрования. актуемую вакцину применяли на птицефабриках «Приморская», «Арыа-ая»,» Внселковокая». вдну’ использовали поело предварительной иммунизации птицепого-вакциной из лентогенного штамма. гщефабркка^исолкоБСкая»- плоцрелродуктор. Основное направло.’ше-ащяваяив реммолодняка до 90-дневного возраста. Вакцина прпменя

0 следующей схеме: я вакцинация( 10-12 дн)-«Бор-74 ШШ1 «-интраназально; вакцинация ( ¿2-42 ди)/»Бэр-74 .ВШЕ» -интраназально ( но по-ашям ИГА ); | я вакщшцпя ( 62-70 дн.)-«А(в)ВН»- внутримышечно. пршито 42Ь300 голов. После применения испытуемой вакцины пост-алыще ослошюния не отмечались. Применение вакцины из штамма И» обеспечивало 100% напряженность иммунитета,титры опоцифкчес-тмтол к вирусу пыокаслскои ‘болезни через 14 дне:; после гакцина-ходошсь в пределах 6,2-8,3 через 2В дней- 5,7- . ице>а брлка «Армавирская «-яичного направления. / га применялась по следующей схеме: ^ вакшнашя( 10-

;. дк)-«Ла-Сота»-выпаивание; . . ! вакцинация ( 20-22 дн)-‘М:а-Сота»-выпапБаиие ( по показания:;: А):,

«А(б)1;]1» -БЕутркмкшечпо-0,5 мл; ) гаданагепя ( (‘5-71: дп) -«А(б)Ш»-вяутримкшечно-1,0 гл. щлшто Т75С00 голов.; После прймоноыш испытуемо?: вакцин постзпечиэало 100/j напряженность шялукитета ,титри опоц-тфитоотах антптол ipycy Iяыокас леко•5 болезни находились б пределах о. зтаточно высокая ап:-:^генная активность ктрускактчш связала с год отходом птлцн »вкзваяныдз поставкам нодобракачествспдкх корглов. фабрика «Пркиорскал»—шеного направления. Вакщша применялась здукэдеЯ схеме г j вакщиаиия ( 12 дн)-«Бор-74 ВГШ’Ц — вшаиваиие; 1 вакцинация «Еор-74 ВПШ» проводится по показаниям Ш Л, я вакщшацня ( CG-Г.о дн.)

«Л(в)ЗН»- внутряглшючно. Йявпто J2GS0 голов. Применение вакщшк обеспечивало Ю0# напря-сь хшг/упитета, титры антител к вирусу 1Ш составили 0.

•о испытуемой вакциной в Краснодарское крае привито 55С9ЗД голов.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Научная электронная библиотека disserCat — современная наука РФ, статьи, диссертационные исследования, научная литература, тексты авторефератов диссертаций.

источник

Руденко Татьяна Владиславовна

ВАКЦИНА ПРОТИВ НЫОКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ИЗ ШТАММА «ГАМ-61»

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Доктор биологических наук, В.И.Смоленский

Заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации

• Осидзе Н.Г. — Доктор биологических наук, профессор, завлабораторией ЗАО пс птицеводству «Братцевское»

• Рукавишников A.B. — Кандидат биологических наук, главный специалист Отделения ветеринарной медицины РАСХН

Ведущая организация — Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ).

Защита диссертации состоится « ^//^//^liooo г. в назаседании диссерта-

ционного совета Д120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское ш., д.5, ВГНКИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ. [«

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы В условиях специализированных птицеводческих хозяйств первостепенное значение принадлежит иммунопрофилактике инфекционных болезней вирусной этиологии. Высокая концентрация поголовья на ограниченных территориях, одновременное содержание неоднородных по возрасту и физиологическому развитию птиц, использование кормов, обсемененных болезнетворными агентами, постоянное поступление ремонтного молодняка из эпизоотически опасных хозяйств и регионов, создают благоприятные условия для быстрого возникновения и распространения инфекционных болезней, оперативная профилактика и ликвидация которых невозможны без применения современных иммунологических препаратов (Alexander D.J., 1980,1987,1995).

Одной из наиболее опасных инфекций является ньюкаслская болезнь (Ж). Несмотря на обстоятельные исследования в области эпизоотологии НБ, расшифровку молекулярных основ патогенности возбудителя, наличия детально отработанных методов диагностики и профилактики, это заболевание до настоящего времени является актуальным не только для птицеводства стран, стационарно неблагополучных по НБ, но и для европейских государств, многие годы свободных от высоковирулентных вариантов возбудителя (World Animal Health, 1996, 1997).

По данным Международного Эпизоотического Бюро в 1996 г. в мире официально зарегистрировано 2277 неблагополучных по НБ пункта, в 1997 г.-2382, в 1998 г-2385. В последнее время на некоторых континентах начала прослеживаться тенденция их увеличения. Так, в Европе после крупной эпизоотии НБ в 1993-94 гг. (390 зарегистрированных неблагополучных пунктов только в Германии) в 1996 г. было зафиксировано 69 случаев возникновения нькжаслской болезни, в 1997-98 гг.—98.

Поэтому с научной и практической точек зрения представлялась важной и своевременной разработка нового профилактического препарата из вакцинного штамма НБ максимально «поздней» селекции. Такой штамм, обозначенный «ГАМ-61» («А(в)ВН») был получен в начале 70-х годов сотрудником ЦВЛ Михальским Г.А. путем аггенуа-ции на первичной культуре клеток почки теленка и эмбрионах кур высоковирулентного вируса НБ, выделенного от павших 25-ти суточных цыплят птицефабрики «XXII партсъезда» Луховицкого района Московской области. При этом основные иммунобиологические свойства штамма были не изучены.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось создание вакцины против ньюкаслской болезни, отвечающей современным требованиям, предъявляемым к противовирусным биологическим препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить иммунобиологические свойства штамма «ГАМ-61», предлагаемого в качестве продуцента новой вакцины.

• Проверить эффективность вакцины в лабораторных и производственных условиях.

• Разработать технологию изготовления вирусвакцины, методы ее контроля, подготовить нормативную документацию (НД).

1.3. Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

• Изучен механизм формирования ранней резистентности цыплят, привитых штаммом «ГАМ-61».

• Разработан новый метод контроля иммуногенности профилактических препаратов против ньюкаслской болезни по результатам сероконверсии с использованием рефе-ренс-серий вакцин.

• Установлена структурная и филогенетическая близость искуственно-атгенуированных мезогенных штаммов «ГАМ-61» и «Н» с высоко вирулентными изолятами В1фуса ньюкаслской болезни (ВНБ). Доказано, что последовательность нуклеотидных оснований и аминокислотных остатков в сайте разрезания FO-белка вирусов НБ детерминирована, что позволяет дифференцировать штаммы по степени их патогенности. Снижение вирулентности штаммов ВНБ в процессе аттенуации не связано с нуклеотидными заменами в функционально важных участках генов F и HN.

1.4. Практическая значимость. Подготовлена и утверждена в установленном порядке нормативная документация на «Вирусвакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» сухую» (Технические условия 9384-080-95 от 25.12.95 г. и Наставление по применению вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61» № 13-4-2/490 от 27.12.95 г.). Разработана инструкция по изготовлению и контролю вакцины (утверждена директором ВГНКИ 12.1995 г.).

против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакщша сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота». 1.5. Апробация. Материалы диссертации доложены на XIII научной конференции молодых ученых (10.01.1992), на 11-ом Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгрия, 1997), на 10-ой Европейской конференции по птицеводству (Израиль, 1998), а также на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней, Ученого Совета ВГНКИ.

Разработки по материалам диссертации удостоены медали «Лауреат ВВЦ» (постановление № 2345 от 12.98 г.).

1.6. Публикации. Основные положения диссертационной работы отражены в двух заключительных отчетах ВГНКИ: за 1991-1993 гг. № Гос. регистрации 01910034974; за 1994-1996 гг. № Гос. регистрации 01940007075; в комплекте НД на вакцину против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61», а также в 15 научных статьях, включая Патент РФ на изобретение, и «Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• Результаты изучения биологических свойств штамма «ГАМ-61» в сравнении со штаммом «Н» вируса НБ.

• Технология изготовления и контроля вакцины против НБ из штамма «ГАМ-61».

• Методики и результаты разработки количественных показателей оценки иммуно-генности вакцин против ньюкаслской болезни.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на Н98 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

».СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы.

Работа выполнена в 1991+1999 гг. в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстъе Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). Часть исследовашш проведены во ВНИИЗЖ, в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента МСХ и П РФ (ЦНМВЛ).

В работе исг льзовали: штаммы вируса ныокаслской болезни: «ГАМ-61» («А(в)ВН»), «IT’, «Ла-Сота», «В», «Бор-74 ВГНКИ, «Т-53»; ПМВ-2-4,6-9; ортомиксо-вирусы птиц, лошадей, свиней, аденовирус уток и наборы референс-сывороток к ним; первично-трипсинизированные и перевиваемые культуры клеток: ФЭК, ФЭУ, ФЭП, ПЭК, ТБ; Hela, Нер-1, СПЭВ, GA и Ст(КСТ). Морфологические исследования материалов проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100CXII и светового микроскопа «Биолам Ломо». Выделение вируса НБ проводили на СПФ-эмбрионах кур 9-10 сут, возраста по общепринятой методике. Концентрировали путем осаждения ПЭГ6000, очищали в ступенчатом градиенте CsCl-сахароза. Фракционирование градиента проводили с помощью проточного спектрофотометра «Увикорд» (LKB) при 254 нм. Инфекционную активность вакцинных и контрольных штаммов вируса НБ, а также образцов вакцин и вирусных изолятов определяли титрованием на 9-10 сут эмбрионах кур, культурах клеток или цыплятах 20-25 сут возраста по общепринятой методике и рассчитывали по методу Кербера Г. Титр гемагглютининов у штаммов ВНБ устанавливали в РГА микрометодом по известной методике. Нейраминидазную активность определяли с субстратом 4=метилумбеллиферил=Д=нейминидом и выражали в количестве расщепленного субстрата на мл исходного вируса за один час (мкг/мл/ч). Экспериментальное заражение привитых и контрольных цыплят проводили внутримышечно вирулентным штаммом «Т-53» вируса НБ в дозе 3,0 lg ЛД50. Результаты контрольного заражения оценивали положительно при условии гибели цыплят с патологоанатомическими признаками, характерными для НБ. Терморезистентность штаммов ВНБ определяли путем воздействия на вируссодержащую ЭЭЖ температуры 56°С в течение 60 мин, температуры 37°С в течение 7 сут, а также после хране-

ния при 4°С в течение 4 лет (срок наблюдения). Устойчивость к рНз,0 и рНю.о — после 4-х часового контакта. Результаты оценивали по сохранности остаточной гемагглюти-иирующей и инфекционной активностей. Чувствительность штаммов ВНБ к хлороформу изучали по методу A. Nayer и K.Bogel, к эфиру Rovozzo, C.N. Burke, описанных Лярски 3. (1980). Остаточную вирулентность штаммов ВНБ оценивали по индексам интрацеребральной (1CPI) и внутривенной патогенности (IVPI), а также по тесту эмбриональной чувствительности (MDT/MLD) (Alexander D.J., 1995). Наличие специфических антител в сыворотках крови определяли в реакции торможения гемагг-лютинации (РТГА), реакции нейтрализации (РН), постановку которых проводили по общепринятым методикам, и в иммуноферментном анализе (ИФА). Для постановки и учета ИФА применяли иммуноферментные диагностические наборы производства ВНИИЗЖ, ВНИВИП, фирм ГОЕХХ, BioChek, KPL и оборудование Flock Chek (ШЕХХ Laboratories B.V.) или аналогичные установки фирм «Дейнатек» (Англия) и «Оптон» (Германия). Дифференциацию штаммов осуществляли методом ОТ-ПЦР. Нуклеотид-ную последовательность вариабельной области генов F и NH изучаемых штаммов определяли методом прямого секвенирования амплифицированных фрагментов с помощью программируемого амплификатора РТС-100 MiniCycler (MJ Research Inc., США) и набора fmol DNA Seguencing System (Promega, США). При анализе нуклео-тидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей использовали пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology) версия 1.0 (N. J.Knowles, IF AN, Великобритания), с применением алгоритмов филогенетического пакета Phylip 3.5с (Felsenstein J/ PHYLIP, Version 3.5с/ Department of Genetics, University of Washington, Seattle,1993). Оценку клеточного иммунитета проводили в реакции спонтанного розеткообразования по уровню Т-лимфоцитов согласно методике, рекомендованной ВОЗ (1990). Уровень эндогенного и экзогенного интерферона определяли в РН на культуре клеток ФЭК с вирусом везикулярного стоматита штамм «Индиана». Препараты для гистологических исследований в виде парафинированных или замороженных срезов толщиной 5-20 мкм окрашивали по методу Браше пиронин-метиловым зеленым. Результаты учитывали под световым микроскопом (увеличение х4800) по количеству специфически окрашенных плазматических клеток. Препараты для электронноскопического исследования концентрированного и очищенного вируса

готовили методом негативного контрастирования 4% фосфорно-вольфрамовой кислотой. Исследовали при инструментальном увеличении х 40000- 112000.

Изучение биологических свойств штамма «ГАМ-61» проводили совместно с сотрудниками ВГНКИ Горевой И.П., Смоленским В.И., Родиным Ю.В. Постановку ОТ-ПЦР осуществляли совместно с сотрудниками ВНИИЗЖ Дрыгиным В.В., Грибановым О.Г.. Гистологические исследования выполнены совместно с сотрудником ЦНМВЛ Барабановым И.И. Морфологию вакцинного штамма изучали совместно с сотрудником ВГНКИ Могильным Ю.И.

2.2. Результаты исследований.

При электронномикроскопическом исследовании штамм «ГАМ-61» был представлен типичными для парамиксовирусов вирионами округлой или филламентозной форм размером 80-120 нм с пепломерами по всей поверхности мембраны.

В РТГА гемагглютинирующую активность штамма «ГАМ-61» задерживали только сыворотки к парамиксовирусам птиц первого серотипа. Сыворотка к штамму «ГАМ-61», в свою очередь, тормозила гемагглютинирующую активность только штаммов: «Ла-Сота», «Н», «Бор-74 ВГНКИ», «В|» и «Т-53» вируса НБ. Результаты перекрестной РН также подтвердили принадлежность штамма «ГАМ-61» к первому серотипу ПМВ, поскольку Ш во всех случаях имел значение 5,0^6,0 1ё ЭЛДзо/см3 (^ЭИД50/сМ3).

Степень антигенного родства штамма «ГАМ-61» со штаммами «Ла-Сота», «Бор-74 ВГНКИ», «В1», «Н» и «Т-53», рассчитанная по формуле Арчетги и Хорсфалла, составила 90ч-100 %, что указывало на полную их тождественность.

2.2.3. Нуклеотидное секвенирование генома.

Вследствие недостаточной чувствительности РТГА и РН антигенных различий между штаммами ВНБ в данных реакциях обнаружить не удалось. Поэтому была определена нуклеотидная последовательность вариабельных участков генов НЫ и Б штамма «ГАМ-61» в сравнении с другими вакцинными и эпизоотическими штаммами вируса

НБ в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для выявления структуры, кодируемых данными генами пептидов и возможных молекулярных постат-тенуационных изменений.

В предварительных опытах было проведено компьютерное сравнение нуклеотид-ных последовательностей в гене Б, кодирующем сайт разрезания Ро-белка 18 вакцинных и вирулентных штаммов, в том числе 6, выделенных на территории России, со значительным временным интервалом (1953-1996 гг.). Была выбрана система прайме-ров, позволяющая проводить амплификацию участков генов НЫ и Р штаммов ВНБ и получать косвенную информацию об изменении антигенной структуры длительно циркулирующих вирусов.

По нуклеотидным последовательностям почти все штаммы вируса НБ были распределены в 6 групп патогенности, для которых последовательности аминокислотных остатков в сайте расщепления Ро-белка были четко детерминированы. Не соответствовали этой закономерности только три, анализируемых в опытах штамма: «Котагоу» и «Веаис1еНе С/45 и штамм «298/84».

Для штамма «Т-53», выделенного на птицефабрике «Томилинская» в 1953 г., последовательность а.о. в данном сайте разрезания была ЮК^КИР, что характерно для представителей VI группы, имеющих самые высокие индексы патогенности (1СР1/1 \Ф1> 1,7/2.4 -2,9). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности у другого высоковирулентного штамма «№3», выделенного нами в 1991г. на Ставропольской птицефабрике, на 2-3% отличалась от штамма «Т-53» (МК^ИИ7), что могло быть доказательством изменения антигенной структуры полевых вирусов НБ, циркулирующих в настоящее время в птицехозяйствах страны. По соотношению индексов — он был отнесен также к VI группе патогенности.

Последовательность аминокислотных остатков, установленная у штамма «БОР-74 ВГНКИ» (СКСЮКЬ) являлась характерной для слабовирулентных вирусов НБ и при соотношении индексов патогенности 0.0/0.0 позволяла отнести его к группе 1Ь, куда входят большинство известных лентогенных вакцинных вариантов ВНБ.

Нуклеотидная последовательность участков генов Б и НИ штамма «Бор-74 ВГНКИ» была сравнена со штаммом «Бор-82», выделенным Ю.Х.Креймером в 1982 г., также как и штамм «Бор-74 ВГНКИ», от цыплят птицефабрики «Боровская» Тюмен-

ской области. Установлено, что кодируемый изученным участком гена F фрагмент белка Fo за 8 лет естественной циркуляции вируса не претерпел каких-либо изменений. Белок HN за это же время подвергся существенным изменениям (2,7% нуклео-тидных и 2,5% аминокислотных отличий) и хотя эти замены оказались консервативными, полученные результаты также доказывали наличие антигенной изменчивости штаммов ВНБ в процессе эволюции. Филогенетический анализ относит эти штаммы к группе асимптоматичных вирусов.

Результаты ОТ-ПЦР, а также данные филогенетического анализа показали структурную (по изучетгым пептидам) и филогенетическую близость штаммов «ГАМ-61» и «Н». Оба штамма были получены путем аттенуации велогенных вирусов НБ, что, тем не менее, не привело к существенным изменениям в структуре пептидов, кодируемых генами F и HN, поскольку последовательность аминокислотных остатков в сайте разрезания пептида Fo штаммов RRQRRF была характерна для велогенных представителей и снижение патогенности вируса в результате аттенуации, видимо, обусловлено другими причинами.

2.2.4. Устойчивость штамма «ГАМ-61» к химическим и физическим факторам.

Была изучена устойчивость штамма «ГАМ-61» к эфиру, хлороформу, кислой и щелочной среде, температурному воздействию. После обработки вируссодержашей ЭЭЖ эфиром и хлороформом в течение 18ч при температуре 4°С инфекционный титр снижался на 3,75+5,0 Ig ЭЛД50 и 2,25+6,6 lg ЭЛД50 (признаки Eth+, Ch+).

Четырехчасовое воздействие кислой (plh.o) и щелочной (рНю.о) среды существенной потери инфекционной и ГА-активности шт. «ГАМ-61» не вызывало (признаки рНз.о», рНю.о’).

Прогревание ЭЭЖ при 56°С в течение одного часа не приводило к полной инактивации изучаемого штамма, поскольку остаточные ГА- и инфекционный титры были в пределах 2,25±0,25 log2 и 1,75+0,25 lg ЭЛД50. При 37°С инфекционная и ГА- активность сохранялись в течение 7 сут, хотя потери достигали 2,5+0,5 lg ЭЛД50 и 3,25+0,25 log:. Полученные результаты позволили сделать заключение о достаточно высокой термостабилыюсти шт. «ГАМ-61» (признак Ts») и открывали перспективы создания нового профилактического препарата с пролонгированным сроком годности.

Нами впервые была изучена стабильность шт. «ГЛМ-61» в сравнении с «Н» и «Т-53». Установлено, что под воздействием температуры 56°С вакцинный шт. «Н» сохранял часть исходной биологической активности на уровне, сопоставимом с показателями шт. «ГАМ-61″, тогда как высоковирулентный шт.»Т-53″‘- практически полностью инактивировался. Данные опыта позволили сделать заключение о терморезистентности шт. «ГАМ-61» (признак Те») и свидетельствовали о свойственной штаммам ПМВ-1 неоднородности по показателям термостабильности.

2.2.5. Гемагглютшшрующая и ненрамшшдазная активность. Штамм «ГАМ-61» агглютинировал эритроциты кур, голубей, уток, гусей, кроликов, морских свинок, барана, крупного рогатого скота, при этом ГА-титр достоверно не отличался.

Нейраминидазная активность штамма имела значение 1500+50 мкг/мл/ч, что было выше на 100-120 ед., чем у шт. «Н» и ниже на 400 и 1628 ед., чем у шт. «Ла-Сота» и «Бор-74 ВГНКИ». Полученные данные согласовывались с известной закономерностью об обратной зависимости между нейраминидазной активностью и вирулентностью штаммов вируса НБ.

2.2.6. Способность к репродукции в различных биологических системах.

Способность шт. «ГАМ-61» к репродукции в эмбрионах кур (гс^Ье-признак) оценивали при различных температурно-временных режимах инкубирования и заражающих дозах.

Было установлено, что оптимальной биологической системой являются куриные эмбрионы 9-10-ти суточного возраста, инкубируемые при температуре 37+0,5°С в течение 48ч-72 ч. Максимальный выход вируса наблюдали при инокуляции их в дозе 4,0-=-5,0 ЭЛД50. В данном режиме удавалось получать от одного эмбриона 6,0-7,5 см»1 внруссодержащей жидкости с титром 8,5+9,5 ЭЛД5().

Снижение температуры до 25+0,5°С не обеспечивало накопление вируса с высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностью и в достаточном объеме.

При температуре инкубирования 40+0,5°С показатели репродуктивной активности штамма существенно не отличались от результатов, полученных при температуре 37+0,5°С, однако общий выход ЭЭЖ был снижен, вероятно, за счет более интенсивно-

го испарения околоплодных жидкостей в среднем на 4,0 см3, что делало нерентабельным использование данного режима в целях накопления вируссодержащей ЭЭЖ.

Экспериментально доказанные условия оптимальной репродукции вируса в КЭ явились основой разработанной инструкции по изготовлению и контролю вирусвак-цины из штамма «ГАМ-61».

Была также изучена способность штамма к размножению в 5 первично-трипсинизированных и 5 перевиваемых клеточных линиях (гс^-прйзнак). Во всех случаях репродукция шт. «ГАМ-61» характеризовалась образованием рефрактильных групп клеток, которые можно было наблюдать уже через 24 ч после заражения. В дальнейшем появлялись симпласты, содержащие два или несколько ядер, наблюдалась деструкция клеток и отслоение их от стекла. Уровень гемагглютинина после трехкратного пассирования не превышал 2,0+3,0 1оцг, а инфекционный титр был не выше 3,0+3,5 ^ ТЦД50. Полученные результаты позволили сделать заключение, что культуры первичных и перевиваемых клеток непригодны для целей получения вакцины из шт. «ГАМ-61» и позволили характеризовать гс£са1 отрицательно. 2.2.7. Вирулентность.

Вирулентность шт. «ГАМ-61» оценивали по индексам патогенности при внут-римозговом (1СР1) и внутривенном (1УР1) его введении цыплятам, которые рассчитывали по методу Хансона, и тесту эмбриональной чувствительности (МЕ>Т/МЫ)).

При определении 1СР1 проявление клинических признаков заболевания наступало на 4-е сут, гибель на 5-7-е сут. При вскрытии павшей птицы отмечали энтериты, гастриты, кровоизлияния в пейеровых фолликулах, на границе мышечного и железистого желудка. Значение 1СР1 находилось в диапазоне 1,41+1,45, что свидетельствовало о принадлежности шт. «ГАМ-61» к мезогенной группе ВНБ. При определении 1УР1 признаки заболевания проявлялись на 5-8 сут, при этом гибели и параличей не наблюдали. 1УР1 был равен 0,1, что характерно для представителей мезогенных штаммов вируса НБ. Величина МЕ)Т/МЫ) составила 72-90 ч, что также свойственно мезоген-ным штаммам вируса НБ.

Индексы патогенности для шт. «Н» были выше на 0,35; 0,31, МОТ/МЮ меньше на 12 ч. Полученные результаты давали объяснение факту отсутствия вирулентности

шт. «ГАМ-61» для цыплят раннего возраста и наличию остаточной реактогенности у шт. «Н».

В течение 15-ти циклов пассирования на КЭ шт. «ГАМ-61», практически, полностью сохранял исходные показатели инфекционный, ГА-активности и иммуногенности. Инфекционный и ГА-титр штамма колебался на уровне 9,0-^9,5 ^ ЭЛД50 и 6,5+7,7 1о^ и не зависел от количества проведенных пассажей (р ньюкаслской болезни в реакции торможения гсмагглютинации (РТГА)», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 23.06.97 г.

4. Внесены изменения в разделы ТУ 9384-080-95 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «ГАМ-61»; ТУ 46-21-567-80 «Вирусвакцина против ньюкаслской болезни из штамма «БОР-74 ВГНКИ»; ТУ 9384-010-00008064-98 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Н»; ТУ 10-19-212-86 «Вирусвакцина сухая против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота» по контролю иммуногенности серий вакцин, исключающие экспериментальное заражение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. Пост вакцинальная инфекция у цыплят, иммунизированных вирусом ньюкаслской болезни//Сб.научн.тр ВГНКИ, 1994.-т.55.-с.214-218.

2. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. Совершенствованш методики контроля вакцин против НБ//С6. науч. тр. ВГНКИ,1995.-т.57.-с.56-63.

3. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. Сухая вирусвакцин; против ньюкаслской болезни из мезогенного штамма «ГАМ-61; (« А(в)ВН»)//Ветеринария, 1995.-5 .-с.8.

4. Патент РФ на изобретение; «Штамм Paramyxovirus, используемый для изготовле ния вакцины против ньюкаслской болезни кур» патент № 2055890 от 10.03.96.Г.

5. Смоленский В.И., Руденко Т.В. Механизм формирования иммунитета при исполь зовании вакцины против ньюкаелкой болезни из штамма «ГАМ-61 »//Тезисы доклад научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня основали Курской биофабрики, Курск,1996.-с.298-300.

6. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин Ю.В. New «GAM-61» strain vaccine against Newcastle disease//XI th Intemation congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest,1997,- p.207.

7. Смоленский В.И., Руденко Т.В., Родин Ю.В., Горева И.П. Разработка и испытание новой вакцины против ньюкаслской болезни//Вестник ветеринарии, Ставрополь, 1998.-№2.-с.75-82.

8. Родин Ю.В., Смоленский В.И., Руденко Т.В., Горева И.П., Родин В.В. Оценка эпизоотической ситуации и особенности специфической профилактики при ньюкаслской болезни//Вестник ветеринарии, Ставрополь, 1998.-№2.-с.66-75.

9. Смоленский В,И., Руденко Т.В. Иммунопрофилактика ньюкаслской болезни в птицехозяйствах//Ветеринария, 1998.-№12.-е. 18-20.

10. Руденко Т.В. Improvement of methods for control of vaccines against Newcastle disease in the Russian Federation, 10 th European poultry conference, Israel,1998, p.21-22.

11. Грибанов О.Г., Старов С.К., Смоленский В.И., Дрыгин В.В., Гусев A. A. The study of russian strains of Newcastle disease virus//10th European poultry conference, Israel, 1998.p.78..

12. Григоренко А.И., Махлай A.A., Колосков A.B., Крамской Н.В., Смоленский В.И., Горева И.П., Токарик Э.Ф., Руденко Т.В., Фисинин В.И., Филоненко В.И. Сухая живая вакцина против ньюкаслской болезни «Оровак-НБ»//Ветеринария,1999.-№10.-с.20-23.

13. Грибанов О.Г., Перевозчикова Н.А., Старов С.К., Смоленский В.И., Руденко Т.В. Штаммовая дифференциация вируса ньюкаслской болезни с помощью обратной транскрипции-ПЦР и секвенирования: смена популяции//Молекулярная биология,1999,-№10.-с.20-238.

14. Методические указания по определению уровня ангител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемаггшотинации (РТГА). МСХ и П РФ 23.06.97 г.

15. Смоленский В.И., Руденко Т.В. Иммунобиологические свойства нового штамма вируса ньюкаслской болезни//Аграрная наука,2000,- № 2, с.13-18.